小桐子類固醇還原酶基因Jc5β-StR的克隆和表達分析

黃堯瑤文錦芬鄧明華龔明陳浩維

（1. 昆明理工大學現代農業工程學院，昆明 650500；2. 昆明理工大學建筑與城市規劃學院，昆明 650500；3. 云南農業大學園林園藝學院，昆明 650201；4. 云南師范大學生命科學院，昆明 650500）

小桐子類固醇還原酶基因Jc5β-StR的克隆和表達分析

黃堯瑤1文錦芬2鄧明華3龔明4陳浩維1

（1. 昆明理工大學現代農業工程學院，昆明 650500；2. 昆明理工大學建筑與城市規劃學院，昆明 650500；3. 云南農業大學園林園藝學院，昆明 650201；4. 云南師范大學生命科學院，昆明 650500）

以小桐子（Jatropha curcas L.）cDNA為模版，克隆了Jc5β-StR基因的CDS序列，并對其序列進行了生物信息學分析。序列分析表明該基因包含1 173 bp開放閱讀框（ORF），編碼390個氨基酸。預測其編碼蛋白質的相對分子量為44.23 kD，理論等電點為5.22。Blast搜索結果及進化分析結果表明，Jc5β-StR與蓖麻5β-StR蛋白序列一致性最高（87%）且親緣關系最近。Jc5β-StR是一個短鏈還原酶，該蛋白編碼有一個短鏈還原酶家族（SDRs）的黃體酮5β還原酶（5β-POR），還含有SDRs的6個保守結構域。組織表達結果顯示Jc5β-StR在小桐子根、莖、葉、花、果皮和種子中都有表達，在種子中表達量最高，且隨種子發育過程表達量逐漸上升，在種子生長發育的后期（50 d）達到最高值后下降。非生物脅迫（PEG、NaCl、低溫和機械損傷）誘導下，Jc5β-StR的表達量都不同程度上調，推測其參與小桐子非生物脅迫響應。

小桐子；Jc5β-StR；克隆；生物信息學分析；表達分析

短鏈還原酶家族（Short-chain dehydrogenases/ reductases，SDRs）是迄今為止發現的最古老、最大的蛋白質超家族之一，存在各種生物形式中，如古細菌，原核生物，真核生物和病毒等［1-2］。SDR家族成員在脂類、氨基酸、碳水化合物、激素類、異生物質代謝和氧化還原反應傳感機制中發揮重要作用。它們通常催化NADP（H）依賴的反應，其底物包括多元醇、類維生素A、類固醇、脂肪酸的衍生物和異源物質等［3-4］。已報到的SDRs具有廣泛的生物學功能，不僅通過參與許多重要內固醇化合物的合成來調控植物生長發育，如油菜素內酯和強心苷等，還參與植物的脅迫應答。半定量RT-PCR分析證實，在草莓果實發育過程中，草莓短鏈還原酶基因FaSDR的表達量隨著果實的著色快速升高，揭示該基因可能參與草莓果實成熟調控［5］。擬南芥的一個短鏈還原酶基因AtHSD1通過調節油菜素內酯生物合成，來調控植物的生長和發育［6，7］。類固醇5α-還原酶（DET2）也屬于SDR家族一員，是油菜素類固醇物質生物合成途徑的限速酶，GbDET2基因在棉花纖維的起始和快速伸長過程中發揮著重要的作用［8］。從甘藍型油菜中克隆的β-酮脂酰輔酶A還原酶基因BnKCR1和BnKCR2在植株中普遍表達，并在種子與根系中的表達最豐富，在酵母中異源表達這兩個基因恢復了酵母脂肪酸延長酶的活性［9］。胡椒（CaMNR1）和擬南芥（AtSDR1）中的薄荷酮新薄荷醇還原酶（MNR）基因增強了植物對多種病原菌的抗性［10］。

類固醇5β還原酶5β-StR（3-o-Δ4，5steroid 5β-reductase）也是SDR家族的一員，能夠催化多種類固醇基質，在內固醇化合物生物合成途徑上發揮作用。目前對于植物5β-StR的研究報道較少，Herl等［11］在2009年報道了一個擬南芥內固醇5β還原酶基因At5β-StR，其蛋白序列和三維模型都與毛花洋地黃（Digitalis lanata）黃體酮5β還原酶（Dl5β-POR）相似度較高，5β-POR是一種類固醇化合物—強心苷生物合成途徑上的重要催化酶。半定量RTPCR發現擬南芥At5β-StR在莖和根中表達量最高，并且在甘露醇誘導20 h后的表達明顯增強，推測At5β-StR還參與植物滲透脅迫調控。同年，Edyta等［12］研究報道5β-StR因為其碳碳雙鍵活性，所以催化能力要強于5β-POR。

小桐子（Jatropha curcas L.）又叫做膏桐、小油桐、老胖果、油蘆子、麻瘋樹等。原產熱帶美洲，分布于我國廣東、云南、四川、貴州、廣西等省區［13］。小桐子果實含油率高達60%，可以提練出不含硫、無污染、符合歐四排放標準的生物柴油，是中國重點開發的綠色能源樹種［14］。小桐子不擇土壤，耐干旱瘠薄，又是干熱河谷地區荒山造林的優良樹種，具有廣泛的開發利用前景［15-16］。本研究從小桐子中克隆得到一個類固醇5β還原酶基因Jc5β-StR，進行蛋白質序列和功能結構上的探討，并分析其在不同組織和非生物脅迫下的表達變化，以期為進一步研究5β-StR基因的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料小桐子（Jatropha curcas L.）取自于云南省昆明市昆明理工大學現代農業工程學院實驗基地。取小桐子根、莖、葉、花、果皮和授粉后不同發育階段（10、20、30、40、50和60 d）的種子，立即液氮速凍后保存在-80℃的環境中備用。每種組織從10株小桐子樹上取樣，來源于3株樹上的組織混合作為1個組織樣品，4次重復。

實驗處理材料為穩定成熟期的小桐子幼苗，取長勢基本一致的小桐子幼苗分別放置于NaCl（250 mmol/L）培養液、30% PEG 6000培養液和4℃培養箱中，機械損傷用消過毒的剪刀在每個小桐子葉片上各剪5下，注意不要剪斷葉片主脈。4種處理后的0（對照）、3、6、12和24 h取幼嫩的葉片。各處理3次重復，材料用錫箔紙包好，立即液氮速凍后保存在-80℃的環境中備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 小桐子RNA用TianGen公司植物總RNA提取試劑盒（RNAprep pure Kit，DP432）提取，cDNA鏈合成用大連寶生物公司（TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）試劑盒，操作過程參考說明。產物放置于-20℃備用。1.2.2 基因克隆 Jc5β-StR基因克隆特異引物設計為Jc5β-StR-F（5'-CCTCAGCCACCAACTACTA-3'）和Jc5β-StR-R（5'-GTTCAAATCAAGGCACAAT-3'），PCR擴增用大連寶生物公司的Taq酶（TaKaRa Ex Taq Hot Start Version）和5×PCR buffer，cDNA模板加入量為2 μL，操作過程均參考說明。PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環，72℃延伸5 min。將PCR產物連接到pMD18-T并雙向測序，每個基因至少5個克隆。

1.2.3 cDNA序列及其編碼氨基酸分析 用NCBI網站中的ORF finder找出基因的開放讀碼框（open reading frame，ORF）和其BLASTp程序進行同源性分析；用DNAMAN軟件進行核酸翻譯和多序列對比，采用MEGA7.0 Neighbor-joining方法構建進化樹進行親緣關系分析。利用ProtParam在線軟件分析氨基酸殘基數目、組成和蛋白質的基本性質等參數。利用ExPASy在線分析蛋白質一級結構和預測蛋白質功能位點。通過在線軟件SOPMA預測蛋白質二級結構。用Modeling程序（http://swissmodel.expasy. org/）對蛋白質的三級結構進行預測。跨膜結構預測用TMHMM-2.0 server，信號肽預測用SignalP。

1.2.4 基因的表達分析 用實時熒光定量PCR方法進行基因表達分析。根據測序結果設計特異引物序列為Jc5β-StR-qF（5'-GATTTGCCCAGATTAGACGCT-3'）和Jc5β-StR-qR（5'-CAATCCCTCCTTCTTCGCTAC-3'）。內參基因序列設計為β-actin-F（5'-GCAGGCATCCACGAGACTACT-3'）和β-actin-R（5'-GTCAGCAATACCAGGGAACATAG-3'）。分別對反轉錄后不同組織和不同處理材料葉片cDNA進行實時熒光定量PCR分析。反應體系為：2 μL cDNA模板、12.5 μL Premix TaqTM、0.5 μL Jc5β-StR-qF、0.5 μL Jc5β-StR-qR、加dd H2O至25 μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃預變性30 s，59℃退火1 min，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，35個循環。根據廠商推薦，在羅氏LightCycler 480系統上進行。每個材料做3次獨立重復，采用2-ΔΔCT方法分析處理數據，在組織表達分析中用表達量最低的組織作為校正子，在種子發育過程中的時序表達分析用第一發育階段（10 d）的樣品做校正子［17］。用SPSS軟件進行顯著性分析，Excel 2013作圖。

2 結果

2.1 Jc5β-StR基因的克隆

用RT-PCR方法對Jc5β-StR進行克隆，瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上觀察得到一條大約1 200 bp的產物（圖1），對其測序后，用ORF finder軟件分析Jc5β-StR基因編碼氨基酸序列，完整的ORF框編碼區為1 173 bp，編碼蛋白包含390個氨基酸（圖2）。

2.2 蛋白質一級結構分析

通過ProtParam軟件分析表明，Jc5β-StR蛋白相對分子量為44.23 kD，理論等電點為5.22，酸性氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為49個，堿性氨基酸殘基總數（Arg+Lys）為34個，不穩定系數為41.40，為不穩定蛋白。原子總數是6 160個，分子式為C2017H3032N520O578S13。脂肪系數為84.31，疏水系數為-0.299，為親水蛋白。

2.3 蛋白質二級結構及三級結構分析

通過在線軟件SOPMA對蛋白質進行二級結構預測，結果表明Jc5β-StR蛋白含有豐富的α螺旋（Alpha he1ix）占氨基酸殘基總數的40.77%，其次是無規則卷曲（Random coil）占氨基酸殘基總數的33.08%，延伸鏈（Extended strand）占氨基酸殘基總數的17.18%，β-轉角（Beta turn）占氨基酸殘基總數的8.97%（圖3）。

通過Prosite在線數據庫分析，發現Jc5β-StR蛋白序列含有3類功能位點包括2個N-糖基化位點（N-glycosylation site），7個豆蔻酰化位點（N-myristoylation site）和7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（Casein kinase II phosphorylation site）。登錄http://swissmodel.expasy.org/中的MODELING，對小桐子Jc5β-StR蛋白三級建模，結果顯示Jc5β-StR蛋白質三級結構模型以黃體酮5β還原酶（5β-POR）為模板，序列相似度為74.86%，建模結果如圖4所示。2.4 蛋白質亞細胞定位、跨膜結構和信號肽預測

圖1 Jc5β-StR基因電泳檢測圖

蛋白質亞細胞定位預測Jc5β-StR最有可能定位在細胞質。跨膜結構預測結果表明Jc5β-StR不具有跨膜結構域。信號肽預測結果表明Jc5β-StR不具有信號肽，說明它不是一個分泌蛋白。

2.5 Jc5β-StR序列一致性分析

通過NCBI Blast序列比對發現5β-StR基因在多種植物中均存在，Jc5β-StR與大戟科蓖麻（Ricinus communis）序列一致性最高，為87%；其次與胡桃科核桃（Juglans regia）序列一致性為83%，與梧桐科可可樹（Theobroma cacao）序列一致性為82%；與薔薇科白梨（Pyrus bretschneideri）序列一致性為81%；與蕓香科甜橙（Citrus sinensis）、錦葵科陸地棉（Gossypium hirsutum）、薔薇科蘋果（Malus domestica）和梅（Prunus mume）等序列一致性為80%；與大豆（Glycine max）、辣椒（Capsicum annuum）、油菜（Brassica napus）等其他幾十種植物序列一致性為75%-79%。Jc5β-StR與不同種類植物序列一致性較高，說明該基因在植物進化過程中較保守。

圖2 Jc5β-StR全長序列及其推導的氨基酸序列

圖3 Jc5β-StR蛋白質二級結構

圖4 Jc5β-StR蛋白質三級結構

Jc5β-StR屬于NADB Rossmann超家族（圖5）。該蛋白編碼一個短鏈還原酶家族（SDRs）的黃體酮5β還原酶（5β-POR），Jc5β-StR也有含有SDRs的6個保守結構域（圖6），表明Jc5β-StR是一個短鏈還原酶。結構域Ⅰ-Ⅲ在所有NADP依賴的SDRs中都存在，是典型的SDRs結構域，余下的3種Ⅳ-Ⅵ結構域，不是所有的SDRs都存在，特別是Ⅴ結構域（NFYYxxED），是5β-POR類的典型結構域［11］。

2.6 Jc5β-StR進化分析

用MEAG7.0軟件對Jc5β-StR蛋白氨基酸序列和其他植物的5β-StR蛋白進行進化分析，結果表明，Jc5β-StR的進化基本符合植物分類學分類，并具有明顯的種屬特性，如屬薔薇科的蘋果和梨組成一個分支，Jc5β-StR與大戟科蓖麻聚在一枝（圖7），說明其與蓖麻親緣關系最近。

2.7 Jc5β-StR表達分析

圖5 Jc5β-StR保守結構域預測

圖6 Jc5β-StR與不同物種5β-StR氨基酸序列對比

以β-actin作為內參，對小桐子Jc5β-StR在不同組織和種子不同發育階段的表達情況進行qRT-PCR分析，分析結果表明，Jc5β-StR在小桐子根、莖、葉、花、果皮和種子中都有表達，在種子和葉片中的表達量顯著高于其他組織。Jc5β-StR在種子發育過程中的定量分析（圖8）表明，該基因在種子整個生長發育期都有表達，在種子生長發育前期其表達水平不斷增加，在種子生長發育的后期（50 d）達到最高值，然后下降。

Jc5β-StR在PEG、NaCl、機械損傷和低溫4℃處理下表達都不同程度提高，PEG處理下表達水平變化顯著，在第12 h達到最高值，為對照樣品表達量的6倍左右。NaCl處理下12 h達到最高值，為對照樣品的1.8倍左右。機械損傷處理下第6 h達到最高值，為對照樣品的3.7倍左右。4℃處理下Jc5β-StR在第3小時表達水平就達到最高值，為對照樣品的2.5倍左右，之后緩慢下降（圖9）。

圖7 不同植物5β-StR氨基酸序列進化樹分析

3 討論

本研究通過RT-PCR方法從小桐子中克隆了一個小桐子類固醇5β還原酶基因（Jc5β-StR），分析其ORF大小為1 173 bp，編碼蛋白包含390個氨基酸。預測其相對分子量為44.23 kD，理論等電點為5.22。蛋白質亞細胞定位預測其定位在細胞質，沒有跨膜結構域，也不具有信號肽。Blast結果表明Jc5β-StR屬于NADB Rossmann超家族。其序列與同屬于大戟科的蓖麻5β-StR序列一致性最高，為87%，進化樹分析表明其與蓖麻5β-StR親緣關系最近。該蛋白編碼一個短鏈還原酶家族（SDRs）的黃體酮5β還原酶（5β-POR），也含有SDRs的6個保守結構域，證明Jc5β-StR是一個短鏈還原酶。

圖8 Jc5β-StR基因在不同組織（A）和種子不同發育時期（B）的表達

圖9 小桐子Jc5β-StR基因在不同非生物脅迫處理下的表達

類固醇化合物對植物生長發育過程具有調節作用，Mandava報道了甾和皂苷對某些植物的生長過程均有調節作用，特別是甾醇和性激素對一些植物的生長具有促進作用［18］。種子作為小桐子的生殖器官，在發育過程中大量合成和累積類固醇化合物，結合本實驗定量分析結果，Jc5β-StR在小桐子種子中高表達，并且在種子生長發育期表達量上升，種子成熟期（50 d）表達量達到最高值后下降，表達量變化過程與種子生長發育趨勢一致，進一步驗證了5β-StR在類固醇化合物生物合成途徑上的重要作用。保守結構域預測還表明Jc5β-StR也屬于SDRs家族一員，已報到的SDRs廣泛參與植物的初級代謝和次級代謝，在植物生長發育和抗逆機制中發揮重要作用［5-11］。本研究小桐子幼苗在PEG、NaCl、機械損傷和低溫這4種非生物脅迫處理下Jc5β-StR基因表達量都不同程度上調，由此推測Jc5β-StR也參與小桐子非生物脅迫應答。本研究為深入了解5β-StR基因的功能和小桐子的抗逆機制奠定了基礎。

4 結論

本研究報道了小桐子的一個內固醇5β還原酶基因 Jc5β-StR。序列全長1 173 bp，編碼390個氨基酸。該基因編碼的蛋白含有SDRs的6個保守結構域。Jc5β-StR具有組織表達特異性，在種子中表達量最高，還受多種非生物脅迫誘導上調表達。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Analysis of Jc5β-StR Gene in Jatropha curcas

HUANG Yao-yao1WEN Jin-fen2DENG Ming-hua3GONG Ming4CHEN Hao-wei11. Faculty of Modern Agricultural Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500；2. Faculty of Architecture and City Planning，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500；3. Faculty of Landscape and Horticulture，Yunnan
Agricultural University，Kunming 650201；4. School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500）

The CDS sequence of Jc5β-StR gene was cloned with Jatropha curcas cDNA as template，and analyzed by bioinformatics analysis. The opening reading frame（ORF）of Jc5β-StR was 1 173 bp encoded 390 amino acids. The predicted molecular weight was 44.23 kD，and theoretical isoelectric point（pI）was 5.22. Blast searching and phylogenetic analysis showed that Jc5β-StR had highest identity（87%）and closest relationships with the 5β-StR of Ricinus communis. Jc5β-StR was a short-chain reductase，containing a progesterone 5β reductase（5β-POR）in a family of short chain reductase（SDRs），and also 6 conserved domains of SDRs. Jc5β-StR expressed in different tissues of root，stem，leave，flower，seed capsule，and seed，the 1highest in seed；moreover，the expression gradually rose with the development of seed，and declined after peak in the later stage of seed development（50 d）. The abiotic stress such as NaCl，PEG，4℃，and mechanical damage resulted in the up-regulation of Jc5β-StR expression in varied level，indicating that Jc5β-StR involved in the response to abiotic stress.

Jatropha curcas L.；Jc5β-StR；clone；bioinformatics analysis；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1114

2016-12-08

國家自然科學基金項目（31460355）

黃堯瑤，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：358680047@qq.com

文錦芬，博士，副教授，研究方向：植物次生代謝產物；E-mail：wenjf888@163.com