冬棗輪紋病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及其抑制效果

范延輝 王君

（1. 黃河三角洲生態環境研究中心 山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室，濱州 256603；2. 濱州學院生物工程學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，濱州 256603）

冬棗輪紋病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及其抑制效果

范延輝 王君

（1. 黃河三角洲生態環境研究中心 山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室，濱州 256603；2. 濱州學院生物工程學院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，濱州 256603）

旨在篩選出能高效抑制冬棗輪紋病病原真菌的放線菌，為冬棗輪紋病的生物防治提供理論依據。通過純培養法從黃河三角洲貝殼堤島貝沙沉積物中分離獲得198株放線菌，對抑菌作用最強的菌株BK作了進一步研究。通過形態特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析對菌株BK進行了鑒定，并研究了其對冬棗輪紋病菌抑制效果。結果表明，菌株BK對冬棗輪紋病菌絲生長抑制率達72.30%。菌株BK發酵液對離體冬棗果實輪紋病的防效為73.72%，與50% 多菌靈的防效相差不顯著。經鑒定菌株BK為絳紅北里孢菌是一株較為理想的拮抗菌，在冬棗輪紋病生物防治方面有較好的應用前景。

黃河三角洲貝殼堤島；拮抗放線菌；冬棗；輪紋病；抑制效果

沾化冬棗是黃河三角洲地區特晚熟鮮食果品，自推廣種植給廣大棗農帶來了巨大的經濟利益，目前種植面積已達30余萬hm2，年產量近3.5億kg。但隨著冬棗栽培面積的迅速增加，冬棗病害的發生愈來愈重，其中冬棗輪紋病是冬棗采摘季節較為常見并危害嚴重的真菌病害。冬棗輪紋病不僅直接造成冬棗產量下降與品質降低，而且病原真菌可產生對人體有害的代謝物，對人們的健康構成極大威脅［1］。目前，對冬棗輪紋病的防治主要是噴灑化學農藥多菌靈和退菌特［2］，化學農藥具有誘導抗藥性、農藥殘留、環境污染等缺點［3］，嚴重制約了沾化冬棗的可持續發展。放線菌 是一類具有重要經濟價值的微生物資源，是抗生素、酶制劑和免疫調節劑等多種生物活性物質的主要生產者，目前農業和臨床使用的抗生素有四分之三是由放線菌生產的［4］。利用放線菌產生的活性物質制備的生物農藥，因其具有高效、低毒無污染、不易使有害生物產生抗藥性等特點，已成為未來農藥的發展方向［5］。

冬棗輪紋病生物防治相關工作開始的較晚，冬棗輪紋病的病原菌于2005年才被分離鑒定［1］。近年來，馬海玲，劉俊華等［6，7］對苔蘚植物水浸提液對冬棗輪紋病病菌的抑菌效果進行了初步研究，而在拮抗微生物方面鮮有報道［8］。隨著放線菌研究工作的廣泛開展，新放線菌的發現越來越難，大量放線菌和活性代謝產物被多次重復發現和描述［9，10］，這也成為新型放線菌藥物開發的瓶頸。為了破解這些難題，一些學者提出“新來源，新菌種，新基因，新產物，新用途”的概念，建議從新環境來獲得新菌種，發現新的活性物質［11，12］。

黃河三角洲貝殼堤位于山東省濱州市無棣縣、沾化縣境內，與美國圣路易斯安娜州和南美蘇里南的貝殼堤并稱為世界三大古貝殼堤，是典型且特殊的海岸帶生態系統類型［13］。特殊的生境為我們發現放線菌新物種，進而開發新型微生物源農藥提供了良好的資源。本研究旨在從貝殼堤貝沙沉積物中篩選出高效的生防菌，并對其抑菌效果進行研究，以期為冬棗輪紋病的生物防治及微生物源農藥的研發提供基礎材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 貝砂土樣采自貝殼堤汪子島（經度：117°52-56″，緯度：38°14'30″），采樣區域在向海側，樣品采集深度為5-30 cm，共采集土樣20份，置于4℃備用。

1.1.2 供試菌株 供試菌為冬棗輪紋病病原真菌，本實驗室分離保存。

1.1.3 供試菌培養基 病原真菌培養用PDA培養基（馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂15 g；水1 000 mL；pH自然）；放線菌分離采用高氏一號培養基（可溶性淀粉 20 g；KNO31 g；K2HPO40.5 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；NaCl 0.5 g；FeSO4·7H2O 0.01 g；瓊脂 20 g；水 1 000 mL；pH 7.2-7.4）。分離放線菌時，培養基加入重鉻酸鉀，終濃度為100 μg/mL；查氏培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、ISP2（酵母-麥芽膏瓊脂）培養基、ISP4（無機鹽淀粉瓊脂）培養基、ISP6（蛋白胨酵母-鐵瓊脂）培養基、ISP6（蛋白胨酵母-鐵瓊脂）培養基，以及高氏一號培養基用于放線菌培養特征觀察，配制方法參照文獻［14］進行。

1.1.4 供試品種 供試冬棗為沾化冬棗一代，購自濱州市沾化縣。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離篩選 土樣100℃干熱預處理1 h，用無菌水適當稀釋后，涂布于高氏一號平板，28℃恒溫培養1-3周。培養獲得的放線菌根據菌落形態和顏色進行分類和編號，并經反復劃線進行純化。將得到的純培養物接種于斜面培養基上，置于4℃冰箱中保存。菌株對冬棗輪紋病菌的抑制作用采用對峙培養法：打孔法在PDA平板中央接種直徑為5 mm的真菌菌塊，將分離純化的放線菌在高氏一號培養基上培養5 d后，打孔法接于指示菌四周，28℃恒溫培養5-8 d后，觀察抑菌情況。

1.2.2 菌株BK的分類鑒定

1.2.2.1 形態和培養特征 采用蓋玻片插片法培養，將放線菌劃線接種高氏一號瓊脂培養基，28℃培養7 d，觀察并記錄培養菌落特征。取蓋玻片插片用普通光學顯微鏡高倍鏡觀察菌絲體形態。將菌株BK分別接種到查氏、馬鈴薯葡萄糖、ISP2、ISP4、ISP6、ISP6，以及高氏一號培養基上，28℃培養，分別在7、15、30 d 觀察記錄基內菌絲、氣生菌絲和可溶性色素的顏色變化。

1.2.2.2 生理生化特征 參照《放線菌快速鑒定與系統分類》中的方法進行［15］。

1.2.2.3 16S rRNA 序列分析及系統發育樹構建 將菌株BK接種于高氏一號培養基，120 r/min，28℃震蕩培養36 h，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，用正向引物27F（5'-GAGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3'），和反向引物1541R（5''-AAGG AGGTGATCCAGCC -3'），對其16S rRNA基因進行PCR擴增。采用25 μL PCR反應體系：2.5 mmol/ L dNTPs 1 μL、10 μmol /L上游引物1 μL、10 μmol /L 下游引物1 μL、Taq plus DNA聚合酶3 U、1 0× PCR buffer 2.5 μL、模板DNA 0.5 μg。反應條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min。將擴增的產物由北京三博公司進行測序。將獲得的16S rRNA 序列在網站http://eztaxon-e. ezbiocloud.net中進行比對分析，然后利用MAGE 5.0軟件，采用Neighbor-Joining 法構建系統進化樹，確定菌株BK的分類地位。

1.2.3 菌株BK的抑菌和防治效果

1.2.3.1 發酵濾液對冬棗輪紋病菌絲生長的影響 用接種針挑取在高氏一號培養基上活化培養3 d的菌株BK，接種到含15 mL種子培養液的試管中，在28℃培養4 d，按8%的接種量接種到內裝100 mL培養基的250 mL三角燒瓶中，200 r/min 28℃振蕩培養7 d，菌懸液10 000 r/min、4℃條件下離心20 min，上清用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到發酵濾液4℃保存備用。采用含毒介質法測定菌株BK對菌絲生長的抑制作用：分別配制20 mL 含菌株BK發酵濾液的PDA 平板［16］，用打孔器取直徑為5 mm的病原真菌菌絲塊，移入平板中心處，28℃培養5-7 d測量菌絲生長直徑（mm），計算抑菌率。以無菌發酵液和蒸餾水為對照。發酵液分別稀釋5倍、10倍、20倍、50倍和100倍，每個處理重復3次。抑菌率=［（對照菌落直徑-試驗處理菌落直徑）/對照菌落直徑］×100%

1.2.3.2 BK對冬棗離體果實的防效測定 參考文獻［17］中的方法，選擇健康、大小且成熟度接近的冬棗果實，用蒸餾水洗干凈，待果面稍干后在果實上刺一傷口并接種冬棗輪紋病菌孢子懸液（濃度為1×108CFU/mL），于24 h后噴施菌株BK發酵液、50 %多菌靈500 倍液，另設噴無菌水為對照。每個處理15 個果實，3次重復在25℃保溫、保濕貯藏，5 d 后調查病情指數，計算防治效果。

1.2.4 數據分析 試驗數據采用SAS 9.1統計分析軟件進行方差分析，并用Duncan 氏新復極差法檢驗差異顯著性（P< 0.05）。

2 結果

2.1 放線菌的分離與篩選結果

共分離到198株放線菌，經平板初篩獲得對冬棗輪紋病菌有拮抗作用的放線菌8株（圖1），根據抑菌作用的大小，選擇拮抗性最強的一株菌作為本實驗的目的高效菌株，命名為BK（圖2）。經測定，菌株BK遺傳穩定性好，傳代培養6次后，抑菌作用無明顯變化。因此，選定菌株BK作為進一步研究對象。

圖1 8株對冬棗輪紋病菌有拮抗作用的放線菌的菌落照片

圖2 菌株BK對冬棗輪紋病菌的抑制作用

2.2 菌株BK的抑菌效果

2.2.1 菌株BK發酵濾液對菌絲生長的抑制作用 菌株BK發酵濾液對冬棗輪紋病菌菌絲生長具有較強的抑制作用，5倍稀釋液的發酵濾液可完全抑制冬棗輪紋病菌絲生長。隨著發酵濾液濃度的降低對冬棗輪紋病菌菌絲生長抑制率逐漸降低，但下降不劇烈。稀釋10、20、50 和100倍時的抑制率分別為72.3%、61.7%、47.2% 和39.3%。無菌發酵液與蒸餾水對照一致，對菌絲生長沒有抑制作用（表1）。說明放線菌菌株BK分泌在發酵液中的代謝產物質具有較高的抑菌活性。

表1 菌株BK發酵濾液對菌絲生長的抑制率

2.2.2 BK對離體果實輪紋病的防治效果 結果（表2）表明，24 h 后接種處理的冬棗輪紋病的病情指數為14.80，防效為73.72%，與50 %多菌靈500 倍液的防治效果差異性不顯著，說明菌株BK的發酵液對離體冬棗果實輪紋病具有一定的防治效果。

表2 對離體果實輪紋病的防治效果

2.3 菌株鑒定

2.3.1 放線菌菌株BK的形態、培養特征及生理生化特性 結果（圖3）表明，菌株BK為革蘭氏陽性菌，在高氏一號培養基平板上培養7 d 的菌落直徑4-6 mm，表面致密、干燥、多皺、不易挑起。菌絲細長，分枝多，孢子呈橢圓形表面光滑，孢子絲呈螺旋形（圖4）。菌株BK在大多數培養基上不產生可溶性色素，氣生菌絲白色或灰白色，基內菌絲無色、淺黃色或褐色。

圖3 菌株BK的菌落形態（高氏一號培養基28℃培養7 d）

圖4 菌株BK的孢子形態

菌株BK生長溫度22-40℃，pH4-10，NaCl耐受性1%-3%。硝酸鹽還原、淀粉水解試驗、纖維素水解試驗、明膠液化實驗均為陽性，不凝固但胨化牛奶，能夠利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、D-木糖、蔗糖、乳糖，不能利用山梨糖、肌糖、L-阿拉伯糖。2.3.2 BK的16S rRNA分析 BK的16S rRNA基因序列長度為1 406 bp，在GenBank中的登錄號為KF111562，比對結果（圖5）顯示與其同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取其中的12株模式菌株，構建系統進化樹，菌株BK與絳紅北里孢菌（Streptomyces purpureus）NBRC 13927T（AB184547）親緣關系最近，16S rRNA 基因序列相似性為99.15%。因此，結合培養特征和生理生化特性（表3）初步鑒定BK菌株為絳紅北里孢菌（S.purpureus）。

圖5 放線菌BK的16S rRNA基因序列系統發育樹

表3 菌株BK的生理生化特征

3 討論

貝殼堤是典型而又特殊的海岸帶類型，目前，針對黃河三角洲貝殼堤海岸生態系統的研究主要集中在貝殼堤的發育演變［18］、土壤理化特征［19］和植被多樣性和生物區系等方面［20］，有關微生物多樣性的報道甚少［21］。本研究共分離到198株放線菌，其中對冬棗輪紋病菌有拮抗作用的放線菌8株，這說明貝殼堤放線菌資源豐富，值得進一步發掘。本研究分離篩選的菌株BK經鑒定為苯胺紫鏈霉菌，對冬棗輪紋病菌抑制作用較強，其發酵濾液5倍稀釋液對冬棗輪紋病的抑制效果與50%多菌靈可濕性粉劑500倍稀釋液相當。因此，菌株BK具有的防治冬棗輪紋病生防潛力，有進一步開發應用的價值。

菌株BK分離自貝殼堤島，特殊的生態環境可能會賦予其特殊的代謝途徑，進而獲得新穎的活性代謝產物，初步研究表明，菌株BK產生的抗真菌活性成分為脂肽類物質（待發表），下一步我們將對菌株BK活性代謝產物的結構及其抑菌作用機理開展研究，期望BK能在防治冬棗輪紋病方面發揮積極作用。另外，我們目前通過DGGE、宏基因組學等免培養方法對該區域的放線菌資源作進一步研究，以期更全面地闡明該地區土壤放線菌的多樣性，獲得更多具有生物活性的放線菌新種。

4 結論

本研究從黃河三角洲貝殼堤貝沙土樣中分離了198 株放線菌，從中篩選出1 株對冬棗輪紋病具有極強拮抗作用的放線菌菌株BK，經鑒定菌株BK為苯胺紫鏈霉菌 Streptomyces purpureus。菌株BK對冬棗輪紋病菌菌絲生長和離體冬棗果實輪紋病都有很好的抑制效果，是一株較為理想的拮抗菌，在冬棗輪紋病生物防治方面有很好的應用前景。

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（責任編輯 朱琳峰）

Screening， Identification，and Inhibitory Effect of Antagonistic Actinomycetes Against Macrophoma kuwatsukai Causing Winter Jujube Ring Grain Disease

FAN Yan-hui WANG Jun
（1. Research Center for Eco-Environmental Sciences Yellow River Delta，Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta，Binzhou 256603；2. School of Bioengineering，Binzhou University，Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603）

The objective is to select actinomycete which has strong antagonistic ability against winter jujube ring grain disease. Total 198 actinomycetes were isolated by culture-dependent method from the shell sediment in the Seashell Islands of Yellow River Delta，and the strain BK with the strongest antagonistic ability was further studied. Strain BK was identified based on its morphology，physio-biochemical characters and 16S rRNA sequence analysis，and its ability against winter jujube ring grain disease was also studied，providing a theoretical basis in biological control of winter jujube ring grain disease. The results showed that BK significantly inhibited the mycelium growth of Macrophoma kuwatsukai，with inhibitory rate of 72.3%. The control effect of the culture filtrate against winter jujube ring grain disease was 73.7%，which had no significant difference from that by the 50% carbendazim. Strain BK was identified as Streptomyces purpureus. To sum up，strain BK is an ideal antagonistic one，and presents a potential application for the biological control of winter jujube ring grain disease.

Seashell Islands of Yellow River Delta；antagonistic actinomycete；winter jujube；ring grain disease；inhibitory effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0119

2017-02-22

國家自然科學基金項目（31000059），山東省高等學校科技計劃項目（J10LC55），國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201410449034）

范延輝，男，講師，碩士，研究方向：土壤微生物；E-mail：yanhuifan@163.com

王君，女，副教授，博士，研究方向：環境微生物；E-mail：ivywangjun@163.com