一株枯草芽孢桿菌的生長特性及抑藻效果研究

程新 李昆太 黃林

（江西農業大學生物科學與工程學院，南昌 330045）

一株枯草芽孢桿菌的生長特性及抑藻效果研究

程新 李昆太 黃林

（江西農業大學生物科學與工程學院，南昌 330045）

溶藻微生物能引起水華藍藻的快速消亡，從而達到控制水華之目的。為了探討枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorell）的抑制效果，在實驗室條件下研究了枯草芽孢桿菌對兩種藻類生長的影響、抑制藻類生長的作用方式以及發酵液處理下銅綠微囊藻丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）活性。試驗結果表明，篩選出的菌株具有較好的環境適應性和抑制藻類生長的能力，其抑制效果是通過分泌胞外物質實現的。經過枯草芽孢桿菌處理后，銅綠微囊藻的葉綠素a及藻體蛋白含量均顯著低于對照組，而胞內MDA及GSH含量顯著升高，SOD及CAT活性也有增高的趨勢。

枯草芽孢桿菌；藻類；抑制；生長特性

水體的富營養化已成為世界各地水污染治理中普遍遇到的環境問題， 而因此產生的藻類過度繁殖進而引起水華是導致水環境惡化的關鍵因子之一［1］。除了造成水體生物化學性質發生改變和水體功能下降之外，部分藻類還會向水體釋放的有毒次生代謝物質，嚴重危害到人類和動物的健康［2］。如何控制和消除富營養化水體中有害藻類的暴發性增長是生態學和環境科學領域的重要研究課題。

與化學和物理控藻方法相比，生物控藻技術具有成本低、持續周期長等特點，近年來成為研究的熱點［3］，已有大量研究表明采用溶藻細菌、水生植物分泌的化感物質、食藻微小動物和魚類等生物控制技術防治藻類爆發，都具有較好的效果［4］。但綜合現有的研究報道來看，篩選得到的溶藻生物除藻能力低、生長速度慢、治理成本高等缺點仍然是制約生物除藻的關鍵因素［5］，而枯草芽孢桿菌由于具備菌體密度高、培養及運輸方便等優點，在水體污染治理方面具有巨大的應用潛力［6］。本研究以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和小球藻（Chlorella）為目標藻體，篩選對其具有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，并對其生長特性和溶藻方式進行研究，以期為富營養化水體處理及生物控藻提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）及小球藻（Chlorella）均為課題組自行保存。

1.1.2 培養基 枯草芽孢桿菌培養基采用LB固體培養基［7］，115℃滅菌25 min；藻種培養采用BG11培養基［8］，115℃滅菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 溶藻菌的篩選 將銅綠微囊藻及小球藻菌種接至BG11培養基，課題組自行保存的枯草芽孢桿菌采用LB培養基活化8 h（菌細胞濃度大約為1.0×108cells/mL）后按1∶9的比例接入BG11培養基，28℃，光照4.8±0.2 klx（日光燈源）培養，同時設空白對照，培養4 d 后分別測定葉綠素a 濃度和藻體蛋白含量，計算溶藻菌對葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制率。葉綠素a測定采用丙酮提取法，具體測定及計算方法見參考文獻［9］。蛋白質含量測定參照文獻［5］進行，略有改動。培養4 d后，分別取培養液2 000 r/min 離心10 min，用無菌水進行洗滌，重復上述操作4次，最終獲得藻泥，然后用細胞破碎儀對藻泥進行細胞破碎，破碎液在4℃下10 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用紫外線測定其中蛋白質濃度，測定波長為280 nm和260 nm，蛋白質含量（g/L）計算公式如下：蛋白質含量（g/L）=1.55×OD280-0.76×OD260。

1.2.2 菌株及共培養生長曲線測定 將保存在固體培養基上的5#菌株接種到裝有15 mL滅菌LB液體培養基試管中，經過8 h 培養活化后用無菌移液槍按1.0%的接種量接種到裝有100 mL LB液體培養基的三角瓶中，于28℃，150 r/min進行振蕩培養，定時取樣，在721分光光度計上測OD600值。共培養生長曲線方法如下：將生長對數期的5#菌培養液

（菌細胞濃度大約為1.0×108cells/mL），按體積比1 :9 加入到藻培養液中進行共培養。菌藻共培養條件為28℃，光照4.8±0.2 klx（日光燈源），每隔48 h取藻菌培養液，對細胞進行計數，計數方法采用直接計數法，以藻單獨培養液做對照。藻細胞計數參照文獻進行，將藻培養液用力振蕩混勻，然后于無菌操作臺取1 mL加入到2.5 mL EP 管中，再加入1滴KI-I2溶液，染色15 min。每個樣品設3個平行，將染色后液體滴入藻細胞計數板，于光學顯微鏡（100×）觀察并計數，每樣計數10次，計算平均數。1.2.3 環境條件對溶藻菌生長的影響 設置不同溫度、pH 值及鹽度條件研究5#菌株對環境條件的耐受能力。采用LB 液體培養基于28℃、150 r/min條件下進行振蕩培養，24 h后測定發酵液OD600值。

1.2.4 銨及磷酸鹽對溶藻菌生長的影響 向基礎LB培養基中添加不同濃度的NH4Cl及KH2PO4，28℃，150 r/min進行振蕩培養，24 h后測定發酵液OD600值。1.2.5 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量及相關酶活測定 藻細胞裂解液的制備同1.2.1。各種物質含量及酶活測定均采用南京建成生物工程公司生產的測定試劑盒進行，方法參照說明書。

1.2.6 統計分析 除特別說明外，每個試驗均設置3個對照。數據處理及繪圖采用ORIGIN 8.1進行。

2 結果

2.1 枯草芽孢桿菌對藻葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制

以課題組保存的5株枯草芽孢桿菌為篩選對象，研究其生長性能及其對兩種藻類葉綠素a及藻體蛋白合成的抑制效果，結果（圖1）顯示，5株枯草芽孢桿菌對兩種藻類都具有一定的抑制效果，其中以對銅綠微囊藻的抑制效果較好。5#菌株對兩種藻類葉綠素a的抑制率最高，而1#和5#菌株對兩種藻類蛋白抑制率最佳。從生長能力來看，2#菌株的生長速度最快，24 h后OD600可達2.8以上，而5#和1#菌株的生長能力次之。綜上，選擇枯草芽孢桿菌5#作為代表菌株來進行后續研究。

2.2 5#菌株的生長曲線及其對藻生長的影響

分別研究了5#菌株的生長曲線及其對藻類生長的影響，結果如圖2所示。從圖2-A可以看出，5#菌株的遲緩期較短，而對數增長期繁殖速度較快，當培養到15 h左右時，5#菌株的生長量達到最大，經平板計數其最大生物量可達1.0×1010cells/mL以上，隨培養時間延長菌體生物量略有降低。從圖2-B中可以看出，5#菌株與兩種藻類共培養過程中，銅綠微囊藻和小球藻的生長均受到一定的抑制，其中以銅綠微囊藻所受影響最為顯著。

2.3 環境因子對枯草芽孢桿菌生長的影響

5#菌株在不同溫度、pH及NaCl濃度條件下的生長情況（圖3）顯示，其在低溫條件下生長會受到一定的抑制，而在30-37℃條件下生長最為良好。從酸堿適應情況來看，該菌株在中性條件下生長最為良好，過酸或過堿的條件均會對其生長 造成不利影響，而高濃度的鹽也會對其生長造成不利的影響。

2.4 銨及磷酸鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響

從圖4的結果可以看出，在基礎培養基基礎上適當增加氮、磷的含量，能夠提高5#菌株的生長能力，但當營養物質繼續升高時，菌體的生長能力受到一定的抑制。

2.5 枯草芽孢桿菌溶藻方式的研究

不同處理條件下的發酵液對藻類生長的抑制效果（圖5）可以看出，去除發酵液后重新懸浮的單一細胞對于銅綠微囊藻和小球藻只有很小的抑制能力，而無菌濾 液的抑制能力則高達60%以上，與未過濾的原菌株菌液的溶藻活性相當，這表明菌株的溶藻活性主要來源于發酵后的濾液，并不需要細菌細胞與藻細胞直接接觸，即菌株對于藻類的抑制效應并不是通過直接溶藻方式，而是通過產生溶藻活性物質到濾液中以間接溶藻方式實現的。

圖1 不同菌株的生長能力（A）及其對葉綠素a（B）及藻體蛋白（C）的去除率

圖2 5#菌株的生長曲線（A）及其對藻類生長的影響（B）

2.6 枯草芽孢桿菌對藻細胞抗氧化系統的影響

選擇銅綠微囊藻為目標藻種，研究在細菌溶藻過程中細胞的抗氧化系統（MDA、GSH、SOD和CAT）含量（活性）的變化，結果如圖6所示。加入溶藻細菌后，銅綠微囊藻的MDA含量從第1天便開始上升，這可能與此時藻細胞膜結構受到嚴重損傷有關，而對照組MDA的測定值一直維持在較低水平，說明其脂膜過氧化水平很低。而GSH含量、SOD及CAT活性的變化也有類似的趨勢。說明加入溶藻細菌后，藻細胞受到氧化脅迫，其抗氧化系統啟動以保護自身細胞不受損害。

圖3 溫度（A）、pH（B）及NaCl濃度（C）對5#菌株生長的影響

圖4（A）及（B）對5#菌株生長的影響

圖5 菌株5#對藻類生長的影響

3 討論

工農業和生活污染排放等因素所導致的水體富營養化和浮游藻類污染目前有日益加劇的趨勢［10］，目前已引起研究人員的廣泛關注［11］。通過溶藻病毒、溶藻細菌、溶藻真菌、放線菌等微生物來控制藻體的水華已成為近年來研究的熱點，其中最為常見的是利用溶藻細菌的作用來抑制藻類生長［12］。惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）［13］、熒光假單胞菌（Pseudomonas. fluorescens）、噬胞菌（Cytophaga）等微生物均對藻類有一定抑制作用［14］，但這些從水體等環境中直接篩選得到的微生物雖然有較好的溶藻特性，但普遍存在生長速度緩慢、環境適應性差等缺點，且部分菌株為條件致病菌，在水體治理領域容易造成二次污染，不能大規模使用。枯草芽孢桿菌在自然界廣泛存在，具有生產成本低、生長速度快、易形成芽孢方便運輸等優點，在水質凈化、動物飼料添加等方面有廣泛的應用。尤為重要的是，枯草芽孢桿菌具有良好的生物安全性，不會造成環境的二次污染，因此我國《飼料添加劑品種目錄（2013）》及美國食品藥品監督管理局《可直接飼用微生物目錄（1989）》中均將其列入其中［15］。本研究以課題組保存的枯草芽孢桿菌為篩選對象，不僅考慮其溶藻特性，同時兼顧生物安全性和應用潛力。

目前利用微生物進行藻類控制的研究可以分為兩大類型，一是利用微生物的次級代謝產物抑制藻類生長，目前已有較多報道［16］。張化俊等［14］發現溶藻細菌BS01所產得二異丁氧基苯基胺能夠通過引起藻細胞內部氧化損傷的方式引起藻細胞的死亡，同時該化合物僅針對少數幾種藻類具有殺藻效果，在赤潮的治理方面具有較好的應用前景；孔赟等［17］發現橄欖網狀鏈霉菌SG-001的活性物質能夠強烈抑制銅綠微囊藻的生長，但對小球藻的生長具有明顯的促進作用；Sakata等［18］從日本海域中分離得到1株Pseudomonas sp. C55a-2，對角毛藻、海洋卡盾藻等藻類均具有較好的抑制作用，經過鑒定其主要活性成分為2，3-二氫吲哚二酮（2，3-indolinedione）。另外一類則是研究直接添加菌體對藻類的抑制效果［19，20］。從使用的角度來說，直接施用發酵菌體顯然成本更低，更具備規模化使用的潛力。

圖6 菌株5#對銅綠微囊藻MDA（A）、GSH（B）含量及CAT（C）、SOD（D）活性的影響

枯草芽孢桿菌在藻類控制等領域的研究尚處于起步階段［21-24］，本研究所得菌株不僅具有較好的抑制藻類生長特性，同時在溫度、pH及鹽濃度等方面具有較好的環境適應性，特別是在中溫（30-37℃）、pH接近中性的水體中生長性能最為良好，可以考慮以直投式菌劑的形式應用于富營養化的水體，具備一定的開發的潛力。

4 結論

本實驗篩選得到一株對銅綠微囊藻和小球藻均具有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，其代謝產物對兩種藻類均有較好的抑制作用，且菌株具有較好的環境適應性。將枯草芽孢桿菌與銅綠微囊藻共培養后，可引起藻體抗氧化系統的應激反應。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research on Growth Characteristics and Algicidal Effects of Bacillus subtilis

CHE NG Xin LI Kun-tai HUANG Lin
（College of Biological Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）

Algicidal microorganisms rapidly kill cyanobacteria，and subseq uently the purpose of controlling algal bloom in water bodies is achieved. To investigate the inhibition of Bacillus subtilis against Microcystis aeruginosa and Chlorell，the Bacillus subtilis cultures were used to study its inhibition and mode of action against these two kinds of algae. The MDA，GSH，SOD and CAT activity in M. aeruginosa when cultured with B. subtilis were measured. The results showed that B. subtilis had a solid adaptability to environment and inhibited the growth of the algae by secreting extracellular substances. The chlorophyll a and protein contents of M. aeruginosa in treated groups were significantly lower than that in the control group，while the MDA and GSH contents as well as the SOD and CAT activity increased obviously when M. aeruginosa was cultured with B. Subtilis.

Bacillus subtilis；algae；inhibition；growth characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0013

2017-01-16

江西省科技支撐計劃（20111BBF60031），江西省教育廳科技項目（GJJ11089）

程新，男，博士，副教授，研究方向：資源微生物學；E-mail：jx_chengxin@hotmail.com

李昆太，男，博士，教授，研究方向：微生物次級代謝；E-mail：atai78@sina.com