鐵皮石斛產業化關鍵科學與技術的突破

斯金平+王琦+劉仲健+劉京晶+羅毅波

[摘要] 針對鐵皮石斛繁殖難、種植難、產品單一等產業發展重大問題，通過鐵皮石斛基因組學研究，明確鐵皮石斛為二倍體、有38條染色體、28 910個蛋白編碼基因及在轉錄組水平上的器官基因表達特異性，具有大量種子而種子沒有胚乳、廣泛生態適應性、多糖合成的基因調控機制，為鐵皮石斛遺傳工程育種和活性藥用成分的開發利用提供了理論基礎；攻克了結實難、發芽難等繁育難題，建立了組培快繁體系，實現種苗工廠化生產，奠定了鐵皮石斛人工種植基礎；建立了鐵皮石斛育種體系，明確了重要經濟性狀的遺傳變異規律，育成鐵皮石斛系列專用品種（品系），解決了實生后代分離嚴重問題，支撐鐵皮石斛產業升級；揭示了目標化合物動態變化規律、養分吸收機制，突破了栽培基質、光調控、精準采收等關鍵技術，建立了設施栽培、活樹附生、巖壁附生、立體栽培、盆栽等系列栽培模式，實現種出鐵皮石斛、種出好的鐵皮石斛。

[關鍵詞] 鐵皮石斛； 基因組學； 品種選育； 種苗繁育； 栽培模式

[Abstract] In view of the significant difficulties of propagation， planting and simple product in Dendrobium catenatum（D. officinale）industry development， a series of research were carried out. Genome study showed that D. catenatum is a specie of diploid with 38 chromosomes and 28 910 protein-coding genes. It was identified that specific genes accumulated in different organs at the transcriptome level. We got an insight into the gene regulation mechanism of the loss of the endospermous seed， the wide ecological adaptability and the synthesis of polysaccharides， which provided a theoretical basis for genetic engineering breeding and development and utilization of active pharmaceutical ingredients. The rapid propagation system was established for applying to industrialized production by overcoming breeding problems on seed setting and sprouting， which laid a foundation for artificial cultivation of D. catenatum. And in order to give a clear explanation of genetic variation of important economic traits， we built up the breeding system. Since special varieties of D. catenatum were bred， it helped solve the problem of trait segregation of seedling progeny and support the improvement of D. catenatum industry. The regulation of dynamic variation of target compounds， together with the mechanism of nutrient uptake， was revealed. The breakthrough of key technologies including culture substrates， light regulation and precisely collection was carried out. Several cultivation modes like facility cultivation， original ecological cultivation， cliff epiphytic cultivation， stereoscopic cultivation and potting cultivation were set up. Above all， the goal of cultivating D. catenatum as well as producing good D. catenatum will be achieved.

[Key words] Dendrobium catenatum （D. officinale）； genome； variety improvement； breeding； cultivation modes

鐵皮石斛Dendrobium catenatum（D. officinale）[1]，始載于《神農本草經》，歷代本草均有記載，具有益胃生津、滋陰清熱、增強免疫力、抗腫瘤等獨特功效 [2]。因繁殖與種植等重大難題，長期以來主要利用野生資源，導致資源枯竭而列為國家保護中藥材，并制約產業發展[3]。20世紀90年代以來，逐一解決了鐵皮石斛產業化的關鍵科學技術問題，形成系列原創性成果，使鐵皮石斛產業從無到有，并形成百億級產業。為了促進成果轉化，本文以作者研究為基礎就該領域相關研究進行總結。

1 鐵皮石斛基因組學取得突破 為鐵皮石斛深入的分子和功能研究提供了基礎

鐵皮石斛全基因組測序研究結果表明[4]，鐵皮石斛為二倍體，有38條染色體，及28 910個蛋白編碼基因。研究發現，鐵皮石斛與蝴蝶蘭一起分享了在K/T線附近發生的蘭科植物全基因復制事件而躲過了大滅絕。鐵皮石斛與蝴蝶蘭擁有幾乎相同基因數量，但是鐵皮石斛由于TPS，R和HSP等基因家族大量擴張，使鐵皮石斛具有極強應對逆境的能力和防止病原物侵害的免疫能力，可在高溫、寒冷、高濕或干旱的環境中生長，形成了能在樹上和巖石上附生的特性而分布于溫帶、亞熱帶甚至熱帶的廣大地區，從而揭示了其廣泛的生態適應性的基因調控機制；發現涉及鐵皮石斛多糖代謝通路及其多糖合成環節中關鍵基因的擴增現象，揭示了鐵皮石斛產生大量多糖和莖干變得肥大的分子機制，為人工合成藥用多糖提供分子基礎；發現鐵皮石斛MADS-box基因家族中參與植物生長發育調控的基因家族ANR1，StMADS11，MIKC* 3個分支出現擴張，從而揭示石斛屬植物形態具有高度多樣性的分子調控機制，而MADS-box Ⅰ類基因家族成員發生了丟失，致使鐵皮石斛具有許多種子而種子沒有胚乳是鐵皮石斛自然繁殖困難的主要原因。研究團隊還開展了鐵皮石斛遺傳多樣性及抗寒基因、多糖合成酶基因的篩選[5-12]。

Meng Yijun等[13]結合RNA，sRNA和降解組測序進行了鐵皮石斛轉錄組水平上的器官基因表達特異性研究，從鐵皮石斛的花、根、葉和莖4個器官的RNA測序結果中得到536 558個轉錄本組裝序列，其中有2 645，256，42，54個轉錄本分別在花、根、葉和莖4個器官中高表達。基于sRNA測序，發現有2 038，2，21，24個sRNA分別在花、根、葉和莖特異性富集。同時，在sRNA測序過程中還檢測到1 047個成熟的候選miRNA。基于對二級結構的預測和測序，從測序轉錄本中鑒定到數十個潛在miRNA前體。有趣的是，有2條sRNA前體中的長莖結構發現與不同階段的降解組處理結果相關聯。對1 047個候選miRNA開展靶基因識別，結果發現1 257個配對組合。在此基礎上，建立了一些包括激素信號轉導、發育、次生代謝和Argonaute1蛋白調控相關的生物學子網絡，研究結果為鐵皮石斛進行深入的分子和功能研究提供了寶貴資源。

針對鐵皮石斛主要活性成分多糖，Zhang等[14]通過轉錄組測序與分析，構建了鐵皮石斛幼年和成年植株的了2個cDNA文庫Dendrobium-1和Dendrobium-2，確定了鐵皮石斛中果糖和甘露糖的代謝途徑及參與其中的135個基因，篩選鑒定了430個糖基轉移酶、89個纖維素合成酶基因和627個參與鐵皮石斛次生代謝的轉錄因子，其中37個差異表達的纖維素合成酶基因在鐵皮石斛的甘露聚糖合成中起著重要作用。研究成果豐富了鐵皮石斛轉錄組信息，并為分離鑒定參與多糖生物合成的候選基因及闡明多糖生物合成機制提供有價值的參考。

2 攻克鐵皮石斛種苗繁育難題 實現種苗低碳生產

研究發現了鐵皮石斛自交不育、花粉黏性低與高活力期短、花結構特殊等自然結果率低的主要原因；在開花后第25天人工控制授粉，結實率達到82.6%，10月下旬至11月初果實成熟，每個蒴果有效種子達5 000粒以上[15]。

通過基本培養基（MS，KC，N6，B5，SH）、植物生長調節物質（細胞分裂素、生長素）、天然附加物（馬鈴薯、香蕉、蘋果）、微量元素、pH等關鍵因素綜合調控，篩選出1/2MS培養基為種子萌發、原球莖分化和試管苗生根的基礎培養基，MS與改良MS培養基為原球莖增殖和壯苗培養的基礎培養基；6-BA 0.5～1.0 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1等植物生長調節物質的組合有效原球莖增殖倍數為11.7；6-BA 2.0～3.0 mg·L^-1+NAA 0.5～1.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1組合原球莖芽分化率達90%以上。種子、莖段、葉片、根尖等外植體均建立了組培快繁體系，并實現產業化生產[16-18]。

通過光強、光周期、光質的研究，發現14 h光照（光照強度10～30 μmol·m^-2·s^-1）、10 h暗培養交替是種子萌發的理想條件，16 h光照（光照強度30～50 μmol·m^-2·s^-1）、8 h暗培養交替是原球莖分化與生根壯苗培養條件；白光有利于叢芽萌發，紅藍混光有利于幼苗生長。綜合利用優化的培養基與日光燈、自然光結合的組培專用光源系統，有效地解決了鐵皮石斛發芽難、幼苗生長慢、能耗大等問題，鐵皮石斛從種子到生根成苗僅需150～180 d，種苗培育期縮短30～60 d，能耗降低70%，空間利用率提高30%[17-20]。

3 建立鐵皮石斛育種體系 實現栽培品種化

因歷代本草都強調產地的作用，《神農本草經》記載“藥有……土地所出，真偽陳新”；孫思邈《千金翼方》中強調“藥出州土”，直至20世紀90年，我國藥用植物育種工作仍處于起步階段。國際上，藥用植物育種起步也很晚，1996年在德國召開了第一次藥用和芳香植物育種研究國際會議。通過全面分析鐵皮石斛種質、入藥部位、生長年限、采收季節、外觀形態與標志性成分的關系，揭示其有效成分的時空變異規律，明確傳統產區的藥材質量差異并非完全由當地的氣候、土壤等環境因素作用于植物當代，而是這種環境因素已使藥材群體產生遺傳分化，形成了有遺傳差異的地理種源，種質（品種）類型決定了藥材的質量。基于鐵皮石斛分布廣、遺傳多樣性豐富，藥材安全性要求高的特點，提出了“全分布區種質資源搜集—農藝性狀、功效成分、功能基因系統評價—種內雜交與分子輔助育種結合—選育專用化品種（無性系、家系）”的鐵皮石斛品種選育新方法[21]。

收集了全國主產區鐵皮石斛種質資源305份，完成遺傳多樣性分析，子代多糖、甘露糖等主要活性成分定量測定，植株高度、粗度、萌蘗能力、抗寒性、抗病蟲害能力等農藝性狀的差異性檢測與評價，分子標記遺傳多態性達到95.3%[22]，多糖量變幅22.6%～57.0%，浸出物量3.5%～26.2%，耐低溫-14.8～0 ℃；在育種親本差異檢測與篩選的基礎上，選擇互補性強的親本進行種內雜交，創制出新種質360份，建立了多樣的鐵皮石斛種質資源庫。

品種專用化包括用途（功效）的專用化，用法的專用化，栽培條件的專用化。如用于加工提高免疫功能的沖劑的鐵皮石斛要求提高免疫功能強、高產，對外觀的要求沒有必要；用于加工楓斗的不僅要求優質、高產，還要求莖的粗細適中；用于鮮食的除了質量、產量因素外，還要求化渣性好、口感好；用于原生態栽培的，必須具有很好的適應環境能力，如抗低溫與高溫能力、干旱與水濕能力、病害與蟲害能力、高光效與高肥效特點。根據鐵皮石斛生物特性，基于綠色生產、品種專用化、種內雜交與分子標記輔助育種結合的品種選育新方法和有性制種無性擴繁的策略，解決了實生后代表型與功效成分含量性狀分離嚴重問題[21]，經子代測定[23-25]選育出質量、產量、抗逆能力、農藝性狀等方面特異性明顯、遺傳穩定、一致性好的“森山1號”、“晶品1號”2個品種和“晶品966”、“晶品6A2B”、“晶品天目山”等優良品系，其中“森山1號”系國內首批符合《中國藥典》質量要求的鐵皮石斛品種，多糖量達32.11%；“晶品1號”系國內首個通過種內雜交選育的鐵皮石斛良種，多糖、浸出物量分別達到46.1%，11.3%，超過2015年版《中國藥典》的84.4%，73.8%，增產61.3%，適合野外生態栽培，2015年特大寒潮中，浙江義烏以南海拔300 m以下區域-9 ℃均能正常越冬；“晶品天目山”品系經歷了2015年寒潮（-14.8 ℃），生長仍然正常，為近野生栽培提供了保障。

4 突破鐵皮石斛栽培關鍵技術 建立系列栽培模式

通過基質、光照、水分、通氣、溫度等關鍵因素與鐵皮石斛生長發育關系的研究，篩選出鐵皮石斛栽培最佳基質——松樹皮，從種植難成活提高到成活率98.0%，實現種出鐵皮石斛[17-18]；揭示了鐵皮石斛多糖、浸出物等功效成分的時空變異規律，其中多糖含量及其組成與開花密切相關，開花顯著消耗鐵皮石斛藥材中的多糖及其甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的量，而開花過程可能有利于木糖、阿拉伯糖的積累；醇溶性浸出物含量與新芽形成、萌動密切相關，新芽萌動醇溶性浸出物迅速下降。根據鐵皮石斛多糖與醇溶性浸出物含量、產量的動態變化規律，提出精準采收技術：改種植后4年全草采收為萌條二年生3月底至開花前采收，生命周期產量提高1倍，多糖含量提高30%[26-30]。對鐵皮石斛氨基酸，總生物堿，以及鉀、鈣、鎂、錳、鋅、鉻、銅、砷、汞、鉛、鎘等金屬元素分析表明，均與種質與采收時機密切相關[31-34]。從鐵皮石斛分離鑒定出2 816個菌株，歸屬3門7綱22目43科57屬，初步研究表明，內生真菌與鐵皮石斛生長與品質形成密切相關，其中DO14菌株與鐵皮石斛種苗共培養，提高生長量5.6%，總多糖量113.7%，甘露糖42.2%，并從其代謝產物中分離到具有抗腫瘤和抗真菌活性的2個新化合物[35-36]。

通過鐵皮石斛營養特性、種植季節、光照與水分調控等關鍵技術研究，在栽培技術創新的基礎上，建立了設施栽培模式[37]，遮陽率70%、松樹皮為基質、3—5月或9—10月種植、3～5株叢栽、2.5萬叢/畝（1畝≈667 m2），生長季節每天噴水1～2 h；活樹附生栽培模式[37-38]，以自然生長的樹木作為載體，50%左右郁閉度、3—5月栽培、露根捆綁1～1.5年生種苗、每天噴水1 h、軟體動物防治，栽培過程不施肥料、不用農藥；巖壁栽培模式[39-40]，以垂直崖壁為載體，栽培過程不施肥料、不用農藥，并使鐵皮石斛回歸自然，種植成本更低、藥材質量更優，其中一年生懸崖栽培鐵皮石斛多糖與醇溶性浸出物含量分別高于設施基質栽培9.2%，2.6%，二年生分別高6.7%，5.3%；立體種植模式[41]，以人工立柱或立木為載體的土地利用率提高2～3倍，基質利用率提高30%，單位面積產量提高50%以上；集成鐵皮石斛栽培關鍵技術，制定了國家行業標準《鐵皮石斛栽培技術規程》。

5 產業升級研發重點

5.1 利用鐵皮石斛基因組學開展鐵皮石斛遺傳工程育種和活性藥用成分的開發利用 我國鐵皮石斛產業近年來快速發展，形成了龐大的產業鏈，年產值高達130多億元，但在產業發展過程中存在種源混雜、偽劣產品充斥市場、產品功效機制不清等制約鐵皮石斛產業的健康和持續發展問題。因此，充分利用鐵皮石斛全基因組圖譜，挖掘鐵皮石斛重要功能基因，開展鐵皮石斛分子標記輔助育種；利用鐵皮石斛多糖與小分子化合物的基因調控機制，開發治療糖尿病及其并發癥、抗憂郁癥、抗衰老、提高記憶力和治療阿爾茨海默氏病等新藥；利用物種適應性機制，研究如何提高人體免疫力的機理，開發保健產品；利用鐵皮石斛特異基因，開展物種保護和品質鑒定，對產業轉型升級具有重要價值。

5.2 從劑型多樣化向功效多樣化轉變 鐵皮石斛產品已經實現沖劑、膠囊、片劑、浸膏、口服液、飲料等等多種劑型，但開發的功效主要是“增強免疫力”“抗疲勞”，而且機制不清，其他有助于降低血脂、降低血糖、改善睡眠、抗氧化、緩解體力疲勞、清咽、降低酒精性肝損傷危害等功效遠未得到開發。研究團隊初步發現，鐵皮石斛內含有的多糖成分在治療糖尿病方面，能起到維持胰島素平衡，對糖尿病、肝纖維化等具有明顯效果；其含有的小分子化合物對于老年癡呆癥具有顯著治療效果，擁有延長壽命的功能，開發潛力巨大。

5.3 鐵皮石斛栽培技術轉型升級 目前90%以上的藥材來源于設施基質栽培，存在土地資源制約，投入大，藥材功效不如野生等問題；以軟體動物為主的鐵皮石斛病蟲害，每年成災面積占栽培面積的50%以上，絕收10%以上，年損失數億元；占鐵皮石斛生物量50%以上的葉、花，有較好的功效，但既不能當食品、也不能當藥材，存在嚴重浪費。因此，研究鐵皮石斛近野生栽培技術，包括森林生態對近野生栽培鐵皮石斛產量與品質的影響規律，明確栽培環境、內生真菌、養分來源與吸收機制；研究鐵皮石斛軟體動物綜合防控技術，調查鐵皮石斛主要有害生物，揭示其發生規律，提出綜合防控技術；研究鐵皮石斛資源綜合利用，包括開展鐵皮石斛葉和花功效與安全性評價，開發以鐵皮石斛葉或花為原料的新資源食品，提高鐵皮石斛綜合利用率，對鐵皮石斛產業轉型升級至關重要。

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[責任編輯 呂冬梅]