植物組織培養技術在中藥資源中的應用

王娟+李金鑫+李建麗+高文遠

[摘要] 植物組織培養技術以其獨特的優勢被廣泛的應用于中藥資源領域，在中藥資源保護方面發揮了重要的作用。該文綜述了近年來植物組織培養的一些應用，包括植物組織培養生產藥用植物活性化合物、遺傳多樣性分析、道地藥材、誘導子應用、生物合成及轉基因植物等。通過以上研究將進一步促進植物組織培養技術的發展，使其在中藥資源領域發揮更大的作用。

[關鍵詞] 植物組織培養； 中藥資源； 誘導子； 生物合成

[Abstract] Plant tissue culture technology has been widely used in the field of traditional Chinese medicine（TCM） resources with its unique advantages， playing an important role in the protection of TCM resources. In this review， some applications of plant tissue culture were summarized， including production of active compounds by using plant tissue culture， genetic diversity analysis， Dao-di herbs， elicitor application， biosynthesis and transgenic plants. Through the above researches will promote the further development of plant tissue culture technology， making it play a greater role in the field of TCM resources.

[Key words] plant tissue culture； Chinese medicine resources； elicitor； biosynthesis

中藥資源是我國中藥產業的基石，隨著我國中藥工藝的快速發展，大型和超大型企業不斷涌現、形成和發展，對我國的中藥資源形成了很大的壓力，近些年中藥材瀕危資源的不斷增加，中藥材價格的不斷增長，足以表明我國資源保護和可持續利用工作的緊迫性和重要性。通過發展植物組織培養技術來解決中藥材的資源問題，對我國具有特殊而且重要的意義。植物組織培養技術的應用可以體現在以下幾個方面：①通過植物組織和器官培養生產活性成分，保護瀕危和珍稀藥用植物資源；②通過遺傳多樣性分析，對植物組織培養材料進行評價；③通過植物組織培養技術研究道地藥材遺傳機制和環境機制；④通過誘導子的添加提高培養物中活性成分含量；⑤利用植物組織培養物進行基因功能篩選、驗證及遺傳轉化研究。本文將從以上幾個方面綜述近年來植物組織培養技術在中藥資源領域中的應用。

1 植物組織培養生產藥用植物活性化合物

藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養技術是生產藥用植物次級代謝產物的一種非常有價值的工具。因此，通過細胞培養生產次級代謝產物的植物將近1 000種，超過600種的活性成分直接由植物細胞培養提供。目前，100多種毛狀根已經成功的被發根土壤農桿菌誘導[1]，主要通過優化培養基和關鍵生理因素去增加毛狀根培養的次級代謝產物的生成。目前，人參，三七，柴胡，甘草，丹參，雷公藤和許多種藥用植物已經制定了不定根培養體系。目前，為了大量的生產次級代謝產物，細胞、不定根、毛狀根已經成功地應用于大規模培養。例如，人參不定根培養已經達到3萬L。金絲桃不定根已經達到500 L，紫錐菊不定根已經達到1 000 L[2]。韓國，CBN生物科技公司，每年生產大約40～45 t人參不定根，這是一個利用植物組織培養生產藥品、食品和化妝品的成功范例。主要研究了培養條件的優化和誘導子的使用來提高次級代謝產物的含量。由WHO資助的半合成青蒿素已經被賽諾菲公司研制成功，其用發酵方法由單糖生產的青蒿酸在2013年已形成60 t左右產能。Phyton為成為世界領先的高品質紫杉醇生產商已進行了巨額投資。我國具有通過植物細胞發酵生產紫杉醇的巨大產能，杜絕了對紫杉樹種植的依賴，也避免了他們與環境、可持續性、可靠性和質量穩定性相關的固有問題。近年來藥用植物細胞，毛狀根和不定根次級代謝產物的積累情況見表1。

近年來，藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養受到了廣泛關注，因為它提供了許多植物次級代謝產物。總的來說，藥用植物的細胞，毛狀根和不定根是逐年增加的，并且它的培養規模已經逐漸擴大。

2 遺傳多樣性分析

植物組織培養是植物快速大量增值的一種潛在工具，并且有利于控制重要次級代謝產物的生成。然而再生植株的遺傳基因會發生一定程度的變異，從而造成植株化學成分的改變及其臨床療效的差異，影響組織培養的優點[40]。因此，必須保證組培植株基因的一致性，以確保植株的質量。用于監測遺傳基因變化的方法有簡單重復序列，隨機擴增多態性DNA和相關序列擴增多態性。

簡單重復序列通常形成具有具體基因，少許具體標記物的種族。隨機擴增多態性DNA方法是一種PCR技術，隨機擴增DNA片段，使用低于最低退火溫度的核苷酸序列的單一引物。這個技術已經廣泛用于種族分類，遺傳作圖和種系發生[41-42]。在吊燈花屬快繁的研究中，在植株的直接芽器官發生，間接芽器官發生和母本植物之間比較基因穩定性，結果顯示通過簡單重復序列和隨機擴增多態性DNA方法，直接芽器官發生的基因和母本植物是相似的，間接芽器官發生的隨機擴增多態性DNA指紋圖譜顯示出低的變異率[40]。相關序列擴增多態性是簡單的有效地生產高再生性和多功能性的全組基因片段。在人參懸浮細胞培養中，通過隨機擴增多態性DNA方法在懸浮細胞與幼苗之間比較基因穩定性，結果顯示懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[43]。在擬南芥懸浮細胞培養中，通過簡單重復序列方法來比較懸浮細胞和擬南芥植株的基因穩定性，發現懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[44]。

3 道地藥材

道地性歸根結底是道地藥材所擁有的基因型受到特定生境（道地產區）中環境因子誘導后表達的產物。因此，基因表達是道地藥材研究的重要環節，而功能基因表達的調控是道地藥材研究的目標之一[45]。揭示道地藥材和非道地藥材在基因表達方面的差異是道地藥材功能基因研究的重要內容。由于基因表達對研究所用RNA材料的要求較高，且通常需要通過對比實驗來完成，造成道地藥材基因表達及調控實驗目前主要集中在實驗室中。由于細胞培養和組織培養周期較短，材料易于獲得，均勻性較好，因此道地藥材功能基因表達與調控研究多是在植物組織和細胞中開展[46]。

例如，黃新等[47]利用mRNA差異顯示技術研究茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞mRNA表達的差異。李娟等[48]考察了碳源、氮源、有機成分對HBsAg轉基因人參細胞生長和HBsAg表達量的影響。劉峻等[49]研究了真菌誘導子影響人參毛狀根總皂苷的合成量。以上研究，雖然距離真正的實現道地藥材功能基因的表達和調控尚有一段距離，但為道地藥材功能基因表達和調控研究積累了思路和方法。

4 誘導子作用機制及其應用

4.1 誘導子的作用機制

誘導子被植物細胞膜或細胞質中的接受體識別后，細胞膜便開始去極化，引起離子通道的開閉，如Ca²⁺從環境中流入細胞質，K⁺和Cl^-流出，或者通過 G 蛋白偶聯，激活第二信使系統，進一步的擴大這種效應，產生植物防御分子，如鈣離子（Ca²⁺）、活性氧（ROS）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）、乙烯（ET）等，進而引起下游防衛基因的表達，改變相關酶的活性，并最終導致次級代謝產物的積累，見圖1[50]。

4.1.1 細胞內信號分子和作用機制 植物細胞信號分子主要作用偶合各種胞內外刺激，包括生物或者非生物刺激，再通過細胞內信號傳導系統使得刺激和細胞間信號級聯放大，最終導致相關酶活性的改變，進而引起一系列生理生化反應。例如，誘導子刺激后，細胞質中鈣離子（Ca²⁺） 濃度的升高、一氧化氮合成、活性氧迸發、茉莉酸合成途徑激活等，誘導防御基因的開啟，刺激代謝途徑中關鍵酶的合成，最終促進植物次級代謝產物的合成[51]。

鈣離子：誘導子刺激后，植物細胞在短時間內出現離子流，如Ca²⁺和H⁺從環境中流入細胞質，K⁺和Cl^-流出等。這些Ca²⁺可以驅動鈣離子受體鈣調蛋白（CaM）的反應，一旦鈣調蛋白激活后，可以進一步激活與鈣調蛋白相關的蛋白激酶，從而引發蛋白的磷酸化，進而引起防御基因的表達[90]。例如，Ca²⁺含量迅速上升后，激活鈣調蛋白，會使大量的NAD（P）H氧化酶被激活，NADPH氧化酶可以催化過氧化物的產生和積累，從而進一步引起并下游一系列的反應，刺激次級代謝物的積累[52]。Ca²⁺內流以后，可作為信號分子激活磷脂酸 C，進而使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解產生 2 個第二信使： IP3（三磷酸肌醇）和 DAG（甘油二酯）。其中，DAG 可以與蛋白激酶結合，激活蛋白激酶 C，從而觸發蛋白磷酸化信號級聯，引起細胞內代謝物的積累。IP3 可以與細胞內鈣庫（如內質網、線粒體、葉綠體、液泡等）上的鈣離子通道受體結合，進而動員細胞內鈣庫中鈣離子的釋放。IP3-Ca²⁺信號途徑被認為是誘導植物抗毒素產生的調節物質[53]。在長春花懸浮細胞過程中加入真菌粗提物作為誘導子時，IP3信號轉導途徑被激活，從而進一步使長春花細胞中生物堿的含量提高[54]。

活性氧：植物防御早期的另一個重要變化是活性氧的迸發現象。活性氧濃度升高可以作為第二信使引發胞內一系列抗性反應，如可以促進結構蛋白和木質素的合成使細胞壁增厚，細胞超敏死亡等，另外，活性氧介導的脂質氧化可以刺激茉莉酸及相關化合物的合成，誘導次級代謝防御基因和次生代謝物合成基因的表達，進而誘導次級代謝[55]。在紅豆杉細胞培養過程中，經尖孢鐮刀菌的細胞壁粗提物誘導后，紅豆杉細胞中活性氧大量積累，最終會導致細胞中紫杉醇的含量顯著上升，與對照相比提高了近4倍[56]。但是高濃度的活性氧，如 O^2-，H₂O₂，OH^-，1O₂會損傷細胞內的成分。抗氧化酶體系，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD）以及過氧化氫酶 （CAT）等，會被激活，從而減輕活性氧的毒性作用，增強植物的耐受性[57]。在丹參細胞培養過程中，Dong等[58]發現在丹參細胞培養基中加入水楊酸，酚類化合物的含量會顯著增加，同時抗氧化物酶SOD，POD，CAT 的活性也會增加。

茉莉酸類：在許多的植物細胞培養體系中，誘導子都可以誘導內源的茉莉酸類物質的合成，其可作為細胞內和細胞間的信號分子，與轉錄因子相互作用，進而調節防御基因的表達，最終導致次生代謝物質的合成[59]。茉莉酸類也可以刺激次級代謝產物合成相關的基因的表達，從而促進一系列次級代謝產物的合成，包括萜類物質、黃酮類物質、生物堿和苯丙烷類物質[50]。在貫葉連翹細胞懸浮培養過程中，在培養基中加入黑曲霉細胞壁的粗提物作為誘導子時，茉莉酸的合成量迅速增加，同時細胞中金絲桃素的含量也迅速增加，而加入茉莉酸合成抑制劑后，細胞中金絲桃素的含量顯著下降[57]。

一氧化氮和水楊酸：在自然界中，水楊酸（SA）是植物與病原菌相互作用的誘導物，它能夠誘導發病機制相關 （PR） 基因的表達及和致病相關蛋白的產生，但是，水楊酸不是存在于所有植物防御代謝中[1]。研究發現，在部分植物的細胞中，水楊酸的迅速合成，可以誘導一些與代謝相關基因的表達，促使一些次生代謝產物的積累，例如，在茜草的培養過程中，SA可以增加細胞中蒽醌類物質的積累[60]。一氧化氮（NO）作為信號化合物，近年來才逐漸被認識。在植物體內，NO可以通過一氧化氮合成酶（NOS）、硝酸鹽還原酶（NR）或者非酶促反應來合成[59]。轉錄組測序的結果表明，NO處理后，可以引起植物細胞內與壓力和抗病性相關的基因的表達，說明了NO信號途徑可能與細胞內的次生代謝相關[61]。另外，NO還可以作用于水楊酸（SA）等信號分子的上游，參與和調控植物細胞中SA等信號分子的生物合成[62]。

其他信號分子：除了上述信號分子外，乙烯和脫落酸都是植物的內源性激素，參與調節植物細胞內生長和發育的多種生理活動，如生長、衰老、植物應激反應等[50]。此外，乙烯、脫落酸等也在誘導子誘導的抗性反應中起重要作用，在不同濃度下它們從抑制和促進兩方面影響次生代謝產物的積累[53]。例如，在加拿大紅豆杉的培養過程中，乙烯可以促進低聚糖和茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞的誘導作用，增加紫杉醇的積累[63]。但是在丹參毛狀根培養中，加入乙烯的抑制劑，反而會促進細胞中3種丹參酮的合成[64]。

4.1.2 轉錄因子 轉錄因子也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動子區域中順式作用因子特異性結合的 DNA 結合蛋白。通過蛋白與基因之間以及蛋白與蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉錄[65]。

誘導子刺激植物以后，往往是多種信號途徑構成一個相互交錯的工作網共同起作用，它們通過相互協調，刺激次生代謝物質的合成。其中，轉錄因子可以對多個信號途徑進行整合，激活防御基因，使得宿主關閉一些基因表達而開啟另一些基因表達的信號傳遞和調控，產生特定的次級代謝產物[66]。例如，真菌誘導子或者茉莉酸甲酯誘導后，可以引起細胞中AP2/ERF轉錄因子家族的轉錄因子的迅速積累，然后AP2/ERF轉錄因子識別的順式元件GCCbox，從而激活乙烯響應基因的表達，進而激活下游異胡豆苷合酶的基因和生物堿合成相關的基因的表達，最終促進生物堿的積累[67]。

4.1.3 抗性基因的表達 誘導子與植物受體的相互識別后，第二信使的形成，會使抗性相關基因激活，從而相應的mRNA累積及相應酶的才會增加，最后促進次級代謝物質的產生。

目前研究得比較多并且己經得到克隆的抗性基因主要有：病程相關蛋白P（R）的基因如幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶等基因； 木質素合成相關酶的基因如PAL，PO等的基因； 富含輕脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸糖蛋白的基因； 鈣離子依賴蛋白激酶的基因；谷胱甘肽S-轉移酶基因等。研究發現，許多植物防御反應基因都是誘導表達的[68]。例如，在草莓的培養過程中，Landi等[69]考察了殼聚糖、苯并噻二唑和有機酸對草莓細胞中抗性相關基因表達量的影響，結果表明，3種誘導子都可以激活與鉀離子通道、聚半乳糖醛酸酶、β-1，3-葡聚糖酶相關的抗性基因的表達，另外，苯并噻二唑也可以上調與鈣離子依賴蛋白激酶、β-1，4-葡聚糖酶、抗壞血酸過氧化酶、谷胱甘肽-S-轉移酶相關的抗性基因的表達量。

4.2 誘導子在組織培養中的應用

4.2.1 誘導子的定義與分類 從植物病理學方面來講，誘導子是一種可以引起植物自身產生抗病反應以產生抗毒素（植保素）和過敏反應來保護自己的化學物質或生物因子；從植物組織培養方面來講，誘導子是一種能促進植物細胞產生目標代謝物以及能引起某一組織內生理變化的化學物質或生物因子[70]。根據來源，誘導子可分為生物誘導子和非生物誘導子。生物誘導子主要包括真菌、細菌、病毒的滅活菌體，細胞粗提物以及某種成分、菌體分泌物以及當病原體或害蟲侵染植物時植物的分泌物等。非生物誘導子主要包括金屬離子、植物內源激素（茉莉酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸等）、化合物、理化因素（紫外光、溫度、超聲、水分、pH、鹽強等）、氣體（臭氧、一氧化氮、過氧化氫、二氧化碳、乙烯等）。

利用誘導子來提高次級代謝產物含量是目前在藥用植物組織培養上常用的方法。其中最常用的是生物誘導子和非生物誘導子[70]。

4.2.2 生物誘導子在植物組織培養中的應用 生物誘導子中研究最多與最廣泛的為真菌誘導子。1968年，Crutckshand等發現首個真菌誘導子Monilinia fructicola（褐腐病菌）菌絲體中的一種小分子多肽Monilicolin A能促進菜豆內表皮的形成與菜豆素的積累[71]。從此真菌誘導子受到越來越多的關注。

真菌誘導子主要包括真菌滅活菌體、真菌活菌、真菌菌體成分、真菌分泌物（培養液）等。在化學成分上主要包括多糖、低聚糖、多肽、蛋白、不飽和脂肪酸等。

真菌滅活菌體誘導子是指將真菌的菌絲體或孢子收獲后，用蒸餾水清洗干凈，放入烘箱烘干后，用研缽研成粉末，加入適量蒸餾水后放入滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。菌絲體或孢子發生降解或部分降解。一般將滅活菌體溶液在一定時間加入植物培養物培養基，處理一定時間來誘導植物培養物的生長以及次級代謝產物的積累。真菌滅活菌體作為誘導子在植物組織培養中的應用，見表2。

真菌活菌作為誘導子是指將一定數目的真菌孢子加入植物組織培養物中。Awad等[86]認為，體外培養植物與栽培植物相比，體外培養通常是無菌環境，缺少與植物共生和非共生的土壤微生物，這可能造成體外培養植物細胞中次級代謝產物含量低的原因。因此，在Taverniera cuneifolia的培養過程中，考察了用5種真菌（黑曲霉、曲霉、青霉、串珠鐮刀霉和凍土毛霉）和5種細菌（噬胺芽孢桿菌、發根農桿菌、致瘤農桿菌、蠟樣芽孢桿菌和豆科根瘤菌）活菌為誘導子，對不定根中的甘草酸含量的積累，結果表明所有誘導子都可以提高不定根中甘草酸的含量，其中加入凍土毛霉后，甘草酸質量分數為4.90 mg·g^-1，加入致瘤農桿菌后，甘草酸達到了6.37 mg·g^-1，均高于空白組（1.46 mg·g^-1）和茉莉酸甲酯（2.57 mg·g^-1）處理組。

真菌菌體成分作為誘導子是指菌體中的某一成分作為誘導子加入植物組織培養物中。周立剛等考查了Fusarium oxysporium Dzf17菌低聚糖對盾葉薯蕷懸浮細胞的影響。首先考察了胞外多糖（EPS），水提菌絲體多糖（WPS）、氫氧化鈉提取的菌絲體多糖（SPS）的添加時間以及多糖濃度對盾葉薯蕷懸浮細胞生長以及細胞中薯蕷皂苷元含量的影響。結果顯示，WPS的效果最好，在細胞培養第25天時加入20 mg·L^-1的WPS可以使細胞生物量、薯蕷皂苷元的含量和產量分別達到空白組的1.34，2.85，3.83倍[87]。接著周立剛等又考察了WPS中低聚糖DP4，DP7，DP10的的添加時間、多糖濃度以及添加次數對盾葉薯蕷懸浮細胞中薯蕷皂苷元含量的影響。結果顯示，在細胞培養分別在第24，26天時連續加入6 mg·L^-1 DP7，在第30天時收獲，薯蕷皂苷元的含量和產量分別為空白組的9.19，12.38倍比單次加入刺激的效果好[88]。此外周立剛等還考察了分別來自于EPS，WPS，SPS的低聚糖EOS，WOS，SOS作用不同時間段對盾葉薯蕷懸浮細胞中防御相關酶（PAL，POD，PPO）活性的影響，結果顯示EOS，WOS都能顯著增加防御相關酶的活性，說明內生菌F. oxysporium Dzf17中的低聚糖可能激活和增強盾葉薯蕷懸浮細胞的防御機制[89]。真菌菌體成分作為誘導子在植物組織培養中的應用見表3。

真菌分泌物誘導子是指將真菌的發酵液收集后，用4層紗布進行過濾，1萬×g 離心20 min后，用0.4 μm的濾膜進行過濾，用旋轉蒸發儀把過濾后的發酵液濃縮到一定體積，放入滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。一般將滅活菌體發酵液在一定時間加入植物培養物培養基，處理一定時間來誘導植物培養物的生長以及次級代謝產物的積累。真菌分泌物體作為誘導子在植物組織培養中的應用，見表4。

4.2.3 非生物誘導子在植物組織培養中的應用 水楊酸（SA）和茉莉酸類化合物 [茉莉酸（JA），茉莉酸甲酯（MJ）]由于可以通過誘導多種植物次級代謝產物合成途徑中基因的表達來促進次級代謝產物含量的增加而廣為人知。除此之外，由于他們可以在低濃度誘導遠離他們合成部分的細胞反應，又被成為植物激素。其中，茉莉酸甲酯類應用最廣泛，目前已經成功應用于人參、柴胡、百部、甘草、西洋參、匙羹藤、柴胡、紫錐菊、雷公藤、睡茄、刺五加、苦艾和積雪草等植物組織培養中來提高細胞中次級代謝物的含量。

在苦艾懸浮細胞培養中，添加1.0 mg·L^-1的茉莉酸以及茉莉酸甲酯可以使其總酚，總黃酮的含量增加，另外，可以提高自由基清除能力[97]。加入10 mg·L^-1的茉莉酸甲酯到人參不定根的培養液中，人參皂苷約32 mg·g^-1是空白組的4.76倍[98]。

化學合成誘導子一般指的是對已知的誘導子進行改造，通過化學合成，在誘導子分子結構上加入一些官能團等，來提高誘導子的誘導能力，增加藥用植物細胞中次級代謝物的積累。其中，最常見的是對茉莉酸甲酯的改造。例如，在三七懸浮細胞的培養過程中加入五氟丙基茉莉酸甲酯、2-羥乙基茉莉酸甲酯以及2-羥基乙氧基乙基，結果發現他們都能顯著增加人參皂苷的含量[99]。Qian等[100]考察了2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞中次級代謝產物的誘導作用，結果發現，2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯能顯著提高紅豆杉細胞中紫杉烷C的含量，質量分數分別達到44.3，39.7 mg·g^-1，均高于對照組（茉莉酸甲酯處理組）的含量（質量分數分別為14.0，32.4 mg·g^-1）。

除了常用的上述這些化合物外，還有一些物理因子如紫外光、溫度、超聲，金屬離子，水分，pH，鹽強，氣體如臭氧、一氧化氮、過氧化氫、二氧化碳、乙烯等都能提高次級代謝產物的含量。

5 生物合成生產藥用植物活性成分

由于生長受到自然環境的影響，許多藥用植物生長緩慢或栽培機制復雜。中藥材中的活性成分存在含量低、結構復雜、不穩定、很難化學合成或產率地下等缺點。利用生物技術生產活性成分有許多優點：包括生長周期短、生產標準化、質量穩定等，為中藥資源保護提供了新的途徑。隨著生物合成技術在青蒿素、紫杉醇，丹參酮和人參皂苷生物合成研究中的應用，預測生物合成技術將成為中藥可持續利用的重要途徑之一。近年來利用生物合成來生產活性成分的例子見表5。

藥用植物有效成分的生物合成是在基因組學的研究基礎上，通過在細胞中構建有效成分的生物合成途徑和代謝網絡，從而實現藥用有效成分的定向、高效的合成，以解決藥用有效成分的生產及藥物研發等一系列問題[52]。植物組織培養在生物合成中的應用包括功能基因的挖掘和基因功能體內驗證。

基因功能基因的挖掘主要是通過轉錄組測序來實現的。Subramaniyam等[101]對MJ處理不同時間的人參不定根進行了轉錄組測序，發現30個轉錄因子，11個GT與人參皂苷合成有關。Nuruzzaman等[102]對MJ處理過的人參不定根以及未處理過的不定根進行測序，發現48個轉錄因子與人參皂苷的合成相關。Jayakodi等[103]對2種人參材料誘導出的不定根以及栽培人參進行了轉錄組測序，發現不定根中90%的基因與數據庫得到一致，17%的基因是栽培品中所沒有的，此外還發現了一些與人參皂苷合成相關的候選功能基因。

基因功能的體內驗證主要是通過在植物組織培養器官體內進行基因沉默以及過表達來實現的。Park等[104]通過把CYP716A53v2基因在PCR 8.0中進行克隆，然后與pH2WG連接構建過表達載體，然后導入農桿菌中，侵染人參胚狀體，經過篩選得到CYP716A53v2過表達根系；另一方面，把CYP716A53v2基因進行沉默，構建相應的沉默載體導入農桿菌中繼而侵染人參胚狀體，經過篩選得到CYP716A53v2沉默根系。研究發現，過表達根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量高于正常根系，沉默根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量低于正常根系，說明CYP716A53v2基因的功能是轉化原人參二醇為原人參三醇。

[參考文獻]

[1] Milen I， Georgiev A I， Pavlov T B. Hairy root type plant in vitro systems as sources of bioactive substances[J]. Appl Microbiol Biot，2007，74（6）： 1175.

[2] Paek K Y， Murthy H N， Zhong J J. Production of biomass and bioactive compounds using bioreactor technology[M]. Netherlands：Springer， 2014.

[3] Gao M B，Zhang W，Li X T，et al.Expression profiling of genes involved in taxuyunnanine C biosynthesis in cell suspension cultures of Taxus chinensis by repeated elicitation with a newly synthesize jasmonate， in situ absorption and sucrose feeding[J].Chin J Biotechnol，2011，27（1）：101.

[4] 趙壽經，侯春喜，徐立新，等. 抑制齊墩果烷型人參皂苷合成支路對達瑪烷型人參皂苷生產能力的影響[J]. 吉林大學學報：工學版，2011，41（3）：865.

[5] Balusamy S R D，Kim Y J，Rahimi S，et al.Transcript pattern of cytochrome P450，antioxidant and ginsenoside biosynthetic pathway genes under heavy metal stress in Panax ginseng Meyer[J].B Environ Contam Tox，2013，90（2）：194.

[6] Moses T，Pollier J，Almagro L，et al.Combinatorial biosynthesis of sapogenins and saponins in Saccharomyces cerevisiae using a C-16α hydroxylase from Bupleurum falcatum[J].Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（4）：1634.

[7] Zhang H C，Liu J M，Chen H M，et al.Up-regulation of licochalcone A biosynthesis and secretion by Tween 80 in hairy root cultures of Glycyrrhiza uralensis Fisch[J].Mol Biotechnol，2011，47（1）：50.

[8] Kim J A，Kim Y S，Choi Y E.Triterpenoid production and phenotypic changes in hairy roots of Codonopsis lanceolata and the plants regenerated from them[J].Plant Biotechnol Rep，2011，5（3）：255.

[9] Torkamani M R D，Jafari M，Abbaspour N，et al.Enhanced production of valerenic acid in hairy root culture of Valeriana officinalis by elicitation[J].Open Life Sci，2014，9（9）：853.

[10] Sun J，Xu J S，Zhao L Z，et al.Induction of hairy roots and plantlet regeneration of Bupleurum chinense DC[J].Acta Pharmaceutica Sinica，2013，48（9）：1491.

[11] Zhu C S，Miao G P，Guo J，et al.Establishment of Tripterygium wilfordii Hook. f. hairy root culture and optimization of its culture conditions for the production of triptolide and wilforine[J].J Microbiol Biotechnol，2014，24：823.

[12] Zhao J L，Zhou L G，Wu J Y.Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures[J].Appl Microbiol Biot，2010，87（1）：137.

[13] Guo J，Zhou Y J，Hillwig M L，et al.CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（29）：12108.

[14] Darvishi E，Kahrizi D，Bahraminejad S，et al.In vitro induction of α-pinene， pulegone， menthol， menthone and limonene in cell suspension culture of pennyroyal （Mentha pulegium）[J].Cell Mol Biol，2015，62（3）：7.

[15] Hao G P，Du X H，Zhao F X，et al.Fungal endophytes-induced abscisic acid is required for flavonoid accumulation in suspension cells of Ginkgo biloba[J].Biotechnol Lett，2010，32（2）：305.

[16] Qiao X L，Jiang S G，Lv X G，et al. Effects of phytohormones on plant regeneration and production of flavonoids in transgenic Saussurea involucrata hairy roots[J]. Biotechnology，2011，27（1）：69.

[17] Li J，Wang J，Li J X，et al. Aspergillus niger enhance bioactive compounds biosynthesis as well as expression of functional genes in adventitious roots of Glycyrrhiza uralensis Fisch[J]. Appl Biochem Biotech，2016，178（3）：576.

[18] Simic S G，Tusevski O，Maury S，et al. Fungal elicitor-mediated enhancement in phenylpropanoid and naphtodianthrone contents of Hypericum perforatum L. cell cultures[J]. Plant Cell Tiss Org，2015，122（1）：213.

[19] Chen J R，Chen Y B，Ziemiańska M，et al. Co-expression of MtDREB1C and RcXET enhances stress tolerance of transgenic China rose （Rosa chinensis Jacq.）[J]. J Plant Growth Regul，2016，35（2）：586.

[20] Park Y J，Thwe A A，Li X，et al. Triterpene and flavonoid biosynthesis and metabolic profiling of hairy roots， adventitious roots， and seedling roots of Astragalus membranaceus[J]. J Agr Food Chem，2015，63（40）：8862.

[21] Wang Y H，He Z S，Sun Y X，et al. Study on the production of alkaloid by cell mass suspension culture of Fritillaria cirrhosa[J]. Chin Med Mat，2011，34（2）：183.

[22] Van Moerkercke A，Steensma P，Schweizer F，et al. The bHLH transcription factor BIS1 controls the iridoid branch of the monoterpenoid indole alkaloid pathway in Catharanthus roseus[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（26）：8130.

[23] Qi X J，Chen R Y，Wang W. Cell suspension culture of Gentiana macrophylla （I）[J].Chin Tradit Herbal Drugs，2010，41（3）：472.

[24] Zhao J L，Zhou L G，Wu J Y. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures[J].Appl Microbiol Biot，2010，87（1）：137.

[25] Gandi S，Rao K，Chodisetti B，et al.Elicitation of andrographolide in the suspension cultures of Andrographis paniculata[J].Appl Biochem Biotech，2012，168（7）：1729.

[26] 曹然，張明生，劉詩雅，等. 不同理化因子對三分三毛狀根生長及其莨菪堿含量的影響[J]. 農業生物技術學報，2014，22（2）：195.

[27] Sun J，Xu J S，Zhao L Z，et al.Induction of hairy roots and plantlet regeneration of Bupleurum chinense DC[J].Acta pharmaceutica Sinica，2013，48（9）：1491.

[28] Verma P，Khan S A，Mathur A K，et al.Fungal endophytes enhanced the growth and production kinetics of Vinca minor hairy roots and cell suspensions grown in bioreactor[J]. Plant Cell Tiss Org，2014，118（2）：257.

[29] Zhu C，Miao G，Guo J，et al. Establishment of Tripterygium wilfordii Hook. f. hairy root culture and optimization of its culture conditions for the production of triptolide and wilforine[J]. J Microbiol Biotechnol，2014，24：823.

[30] Lee Y S，Ju H K，Kim Y J，et al. Enhancement of anti-inflammatory activity of Aloe vera adventitious root extracts through the alteration of primary and secondary metabolites via salicylic acid elicitation[J]. PLoS ONE，2013，8（12）：e82479.

[31] Kikowska M，Budzianowski J，Krawczyk A，et al. Accumulation of rosmarinic， chlorogenic and caffeic acids in in vitro cultures of Eryngium planum L[J]. Acta Physiol Plant，2012，34（6）：2425.

[32] Sheng D F，Chen L. Effects of PEG-6000 stress on tanshinones accumulation in hairy roots of Salvia miltiorrhiza[J]. Chin Tradit Herbal Drugs，2013，44（9）：1181.

[33] Wu HY，Baque M A，Lee E J，et al. Scale-up of adventitious root cultures of Echinacea angustifolia in a pilot-scale bioreactor for the production of biomass and caffeic acid derivatives[J].Plant Biotechnol Rep，2013，7（3）：297.

[34] Sykowska-Baranek K，Pietrosiuk A，Naliwajski M R，et al.Effect of L-phenylalanine on PAL activity and production of naphthoquinone pigments in suspension cultures of Arnebia euchroma （Royle） Johnst[J].In Vitro Cell Dev-Pl，2012，48（5）：555.

[35] Zheng C J，Wu X Y，Wang Z J. Optimization of inducement conditions for hairy roots of Morinda officinalis[J]. Agr Sci Technol，2014，10（1）：77.

[36] Lee Y S，Ju H K，Kim Y J，et al.Enhancement of anti-inflammatory activity of Aloe vera adventitious root extracts through the alteration of primary and secondary metabolites via salicylic acid elicitation[J].PLoS ONE，2013，8（12）：e82479.

[37] Silja P K，Satheeshkumar K. Establishment of adventitious root cultures from leaf explants of Plumbago rosea and enhanced plumbagin production through elicitation[J].Ind Crop Prod，2015，76（1）：479.

[38] Wang Q J，Zheng L P，Sima Y H，et al. Methyl jasmonate stimulates 20-hydroxyecdysone production in cell suspension cultures of Achyranthes bidentata[J].Plant Omics，2013，6（2）：116.

[39] Suthar S，Ramawat K G. Growth retardants stimulate guggulsterone production in the presence of fungal elicitor in fed-batch cultures of Commiphora wightii[J].Plant Biotechnol Rep，2010，4（1）：9.

[40] Chavan J J， Gaikwad N B， Umdale S D， et al. Efficiency of direct and indirect shoot organogenesis， molecular profiling， secondary metabolite production and antioxidant activity of micropropagated Ceropegia santapaui[J]. Plant Growth Regul，2014，72（1）： 1.

[41] Liu W， Li P J， Qi X M， et al. DNA changes in barley （Hordeum vulgare） seedlings induced by cadmium pollution using RAPD analysis[J]. Chemosphere， 2005，61（1）： 158.

[42] Rong Z， Yin H. A method for genotoxicity detection using random amplified polymorphism DNA with Danio rerio[J].Ecotox Environ Safe，2004， 58（1）： 96.

[43] Punja Z K，Feeney M， Schluter C，et al.Multiplication and germination of somatic embryos of American ginseng derived fromsuspension cultures and biochemical and molecular analyses of plantlets[J]. In Vitro Cell Dev-Pl， 2004，40： 329

[44] Sedov K A， Fomenkov A A， Solov′yova， et al. The level of genetic variability of cells in prolonged suspension culture of Arabidopsis thaliana[J]. Biol Bull， 2014，41：493.

[45] 黃璐琦， 郭蘭萍， 胡娟， 等. 道地藥材形成的分子機制及其遺傳基礎[J]. 中國中藥雜志，2008，33（20）：2303.

[46] 黃璐琦，劉昌孝. 分子生藥學[M].北京：科學出版社，2015.

[47] 黃新，邱德有，黃璐琦.茉莉酸甲酯對中國紅豆杉細胞基因表達的mRNA差異顯示研究[J].分子植物育種，2006，4（5）：627.

[48] 李娟，盛維瑾，劉大為，等.鋅離子影響丹參金屬硫蛋白MT2基因表達[J].分子植物育種，2007，5（3）：389.

[49] 劉峻，丁家宜，周倩耘，等.真菌誘導子對人參毛狀根皂苷生物合成和生長的影響[J].中國中藥雜志，2004，29（4）：302.

[50] Zhao J， Davis L C， Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites[J]. Biotechnol Adv， 2005， 23： 283.

[51] 許道琦. 真菌誘導白樺三萜積累的營養生理和分子機制的初步研究[D]. 長春：東北林業大學，2013.

[52] Zhao Q， Hu Y Q， Guo W H， et al. Elicitor-induced indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cell cultures is related to Ca²⁺-influx and the oxidative burst[J]. Plant Sci， 2001， 161： 423.

[53] 崔晉龍，付少彬，高芬，等. 真菌誘導植物次生代謝產物積累的信號機制及在藥用植物中的應用[J].中草藥，2012，43（8）： 1647.

[54] 周敏. 內生真菌及其誘導子與長春花懸浮細胞生物堿合成代謝相關性研究[D]. 長沙：湖南農業大學， 2005.

[55] Li T T， Hu Y Y， Du X H， et al. Salicylic acid alleviates the adverse effects of salt stress in Torreya grandis cv. Merrillii seedlings by activating photosynthesis and enhancing antioxidant systems[J]. PLoS ONE， 2014， 9 （10）：e109492.

[56] 張蓮蓮，談鋒.真菌誘導子在藥用植物細胞培養中的作用機制和應用進展[J].中草藥，2006，37（9）：1426.

[57] Xu M J， Dong J F， Zhu M Y， et al. Nitric oxide mediates the fungal elicitor-induced hypericin production of Hypericum perforatum cell suspension cultures through a jasmonic-acid-dependent signal pathway[J]. Plant Physiol， 2005， 139： 991.

[58] Dong J， Wan G W， Liang Z S. Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzymes in Salvia miltiorrhiza cell cultures[J]. J Biotechnol， 2010， 148： 99.

[59] 黃超.小分子化合物的添加提高人參皂苷產量及其作用機制探索[D].上海：華東理工大學，2013.

[60] Bulgakov V P， Tchernoded G K， Mischenko N P， et al. Effect of salicylic acid， methyl jasmonate， ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes[J]. J Biotechnol， 2002， 97： 213.

[61] Aziz A， Poinssot B， Daire X， et al. Laminarin elicits defense responses in grapevine and induces protection against Botrytis cinerea and Plasmopara viticola[J].Mol Plant Microbe In， 2003， 16： 1118.

[62] Hu X， Neill S J， Cai W， et al. Nitric oxide mediates elicitor-induced saponin synthesis in cell cultures of Panax ginseng[J].Funct Plant Biol， 2003， 30： 901.

[63] Linden J C， Phisalaphong M. Oligosaccharides potentiate methyl jasmonate-induced production of paclitaxel in Taxus canadensis[J].Plant Sci， 2000， 158： 41.

[64] Zhang C H， Yan Q， Cheuk W K， et al. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag⁺ elicitation and nutrient feeding[J]. Planta Med， 2004， 70： 147.

[65] 邢丙聰. 丹參毛狀根中酚酸類和酮類成分合成途徑中bHLH和WD40轉錄因子的調控[D]. 杭州：浙江理工大學，2015.

[66] Fujita M， Fujita Y， Noutoshi Y， et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses： a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J]. Curr Opin Plant Biol， 2006， 9： 436.

[67] Vander F L， Zhang H， Menke F L H， et al. A Catharanthus roseus BPF-1 homologue interacts with an elicitor-responsive region of the secondary metabolite biosynthetic gene Str and is induced by elicitor via a JA-independent signal transduction pathway[J].Plant Mol Biol， 2000， 44：675.

[68] 王勁波. 中生菌素對水稻懸浮細胞主要防衛反應基因轉錄表達的影響[D].北京：中國農業科學院，2002.

[69] Landi L， Feliziani E， Romanazzi G. Expression of defense genes in strawberry fruits treated with different resistance inducers[J]. J Agr Food Chem， 2014， 62： 3047.

[70] 王和勇，羅恒，孫敏. 誘導子在藥用植物細胞培養中的應用[J].中草藥，2004，35（8）：1.

[71] Cruickshank I A M， Perrin D R. The isolation and partial characterization of monilicolin A， a polypeptide with phaseollin-inducing activity from Monilinia fructicola[J]. Life Sci， 1968， 7（1）：449.

[72] Bahabadi S E， Sharifi M， Chashmi N A， et al. Significant enhancement of lignan accumulation in hairy root cultures of Linum album using biotic elicitors[J]. Acta Physiol Plant， 2014， 36 （1）：3325.

[73] Saikat D， Moumita G， Urmi D， et al. Signal transducer and oxidative stress mediated modulation of phenylpropanoid pathway to enhance rosmarinic acid biosynthesisin fungi elicited whole plant culture of Solenostemon scutellarioides[J]. Enzyme Microb Tech， 2014， 66（1）： 1.

[74] Zhang S C， Yan Y， Wang B Q， et al. Selective responses of enzymes in the two parallel pathways of rosmarinic acid biosynthetic pathway to elicitors in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures[J]. J Biosci Bioeng，2014， 117 （5）： 645.

[75] Sudhamoy M， Adinpunya M. Accumulation of cell wall-bound phenolic metabolites and their upliftment in hairy root cultures of tomato （Lycopersicon esculentum Mill.）[J]. Biotechnol Lett， 2008， 30 （1）：1253.

[76] Wang Y， Dai C C， Cao J L， et al. Comparison of the effects of fungal endophyte Gilmaniella sp. and its elicitor on Atractylodes lancea plantlets[J]. World J Microb Biot， 2012， 28 （1）：575.

[77] Hao G P， Du X H， Zhao F， et al. Fungal endophytes-induced abscisic acid is required for flavonoid accumulation in suspension cells of Ginkgo biloba[J]. Biotechnol Lett， 2010， 32 （1）：305.

[78] Wang J W， Zhang Z， Tan R X， Stimulation of artemisinin production in Artemisia annua hairy roots by the elicitor from the endophytic Colletotrichum sp.[J].Biotechnol Lett， 2001， 23 （1）： 857.

[79] Fan G Z， Zhai Q L， Li X C， et al. Compounds of Betula platyphylla cell suspension cultures in response to fungal elicitor[J]. Biotechnol Biotec Eq， 2013， 27 （1）：3569.

[80] Ravi P G， Arvind C， Tukaram D N. Influence of biotic and abiotic elicitors on four major isomers of boswellic acid in callus culture of Boswellia serrata Roxb[J].Plant Omics， 2011， 4（4）：169.

[81] Gao F K， Yong Y H， Dai C C. Effects of endophytic fungal elicitor on two kinds of terpenoids production and physiological indexes in Euphorbia pekinensis suspension cells[J].J Med Plants Res， 2011， 5 （18）： 4418.

[82] Zhao J， Zhong L， Zou L， et al. Efficient promotion of the sprout growth and rutin production of tartary buckwheat by associated fungal endophytes[J].Cereal Res Commun， 2014， 42（3）： 401.

[83] Ming Q L， Su C Y， Zheng C J， et al. Elicitors from the endophytic fungus Trichoderma atroviride promote Salvia miltiorrhiza hairy root growth and tanshinone biosynthesis[J].J Exp Bot， 2013， 64 （18）： 5687.

[84] Zhao J L， Zheng B B， Li Y， et al. Enhancement of diepoxin ζ production by yeast extract and its fractions in liquid culture of Berkleasmium-like endophytic fungus Dzf12 from Dioscorea zingiberensis[J]. Molecules， 2011， 16（1）： 847.

[85] Pereira P S， Fábio K T， Suzelei D C F， et al. Enhanced triterpene production in Tabernaemontana catharinensis cell suspension cultures in response to biotic elicitors[J].Quim Nova，2007， 30 （8）：1849.

[86] Awad V， Kuvalekar A， Harsulkar A. Microbial elicitation in root cultures of Taverniera cuneifolia （Roth） Arn， for elevated glycyrrhizic acid production[J]. Ind Crop Prod， 2014， 54： 13.

[87] Li P Q， Mou Y， Shan T J， et al. Effects of polysaccharide elicitors from Endophytic Fusarium oxysporium Dzf17 on growth and diosgenin production in cell suspension culture of Dioscorea zingiberensis[J].Molecules，2011， 16（1）： 9003.

[88] Li P Q， Mao Z L， Lou J F， et al. Enhancement of diosgenin production in Dioscorea zingiberensis cell cultures by oligosaccharides from its endophytic fungus Fusarium oxysporum Dzf17[J]. Molecules， 2011， 16（1）， 10631.

[89] Li P Q， Luo H Y， Meng J J， et al. Effects of oligosaccharides from endophytic Fusarium oxysporum Dzf17 on activities of defense-related enzymes in Dioscorea zingiberensis suspension cell and seedling cultures[J]. Electronic J Biotechnol， 2014， 17 （1）： 156.

[90] Mou Y， Zhou K Y， Xu D， et al. Enhancement of diosgenin production in plantlet and cell cultures of Dioscorea zingiberensis by palmarumycin C13 from the endophytic fungus， Berkleasmium sp. Dzf12[J]. Trop J Pharm Res， 2015， 14 （2）： 241.

[91] Li Y C，Tao W Y. Effects of paclitaxel-producing fungal endophytes on growth and paclitaxel formation of Taxus cuspidata cells[J]. Plant Growth Regul， 2009， 58 （1）： 97.

[92] MaY N， Han C， Chen J Y， et al. Fungal cellulase is an elicitor but its enzymatic activity is not required for its elicitor activity[J]. Mol Plant Pathol， 2015， 16（1）： 14.

[93] Verma P， Khan S A， Mathur A K， et al. Fungal endophytes enhanced the growth and production kinetics of Vinca minor hairy roots and cell suspensions grown in bioreactor[J].Plant Cell Tiss Org， 2014， 118 （1）： 257.

[94] Li Y C， Tao W Y. Paclitaxel-producing fungal endophyte stimulates the accumulation of taxoids in suspension cultures of Taxus cuspidate[J].Sci Hortic-amsterdam， 2009， 121 （1）： 97.

[95] Chodisetti B， Rao K， Gandi S， et al. Improved gymnemic acid production in the suspension cultures of Gymnema sylvestre through biotic elicitation[J]. Plant Biotechnol Rep， 2013， 7（1）：519.

[96] Verma P， Khan S A， Mathur A K， et al. Improved sanguinarine production via biotic and abiotic elicitations and precursor feeding in cell suspensions of latex-less variety of Papaver somniferum with their gene expression studies and upscaling in bioreactor[J]. Protoplasma， 2014， 251 （3）：1359.

[97] Ali M， Abbasi B H， AliG S. Elicitation of antioxidant secondary metabolites with jasmonates and gibberellic acid in cell suspension cultures of Artemisia absinthium L.[J].Plant Cell Tiss Org， 2015， 120 （4）：1099.

[98] Wang J，Gao W Y， Zuo B M， et al. Effect of methyl jasmonate on the ginsenoside contentof Panax ginseng adventitious root cultures and on the genes involved in triterpene biosynthesis[J]. Res Chem Intermediat， 2013， 39 （8）：1973.

[99] Wang W， Zhao Z J， Xu Y F， et al. Efficient elicitation of ginsenoside biosynthesis in cell cultures of Panax notoginseng by using self-chemically-synthesized jasmonates[J].Biotechnol Bioproc E， 2005， 10 （5）：162.

[100] Chen S L， Zhu X X， Li C F， et al. Genomics and synthetic biology of traditional Chinese medicine[J]. Acta Pharm Sin， 2012， 47： 1070.

[101] Subramaniyam S， Mathiyalagan R， Natarajan S， et al.Transcript expression profiling for adventitious roots of Panax ginseng Meyer[J]. Gene， 2014， 546：89.

[102] Nuruzzaman M， Cao H Z， Xiu H， et al. Transcriptomics-based identification of WRKY genes and characterization of a salt and hormone-responsive PgWRKY1 gene in Panax ginseng[J].Acta Biochim Biophys Sin， 2015， 22：1.

[103] Jayakodi M， LeeS C， Park H S， et al. Transcriptome profiling and comparative analysis of Panax ginseng adventitious roots[J].J Ginseng Res， 2014， 38： 278.

[104] Park S B， Chun J H， Ban Y W， et al. Alteration of Panax ginseng saponin composition by overexpression and RNA interference of the protopanaxadiol 6-hydroxylase gene （CYP716A53v2）[J].J Ginseng Res， 2016，40：47.

[105] Moses T， Pollier J， Almagro L， et al. Combinatorial biosynthesis of sapogenins and saponins in Saccharomyces cerevisiae using a C-16α hydroxylase from Bupleurum falcatum[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111 （4）：1634.

[106] Huang Z W， Lin J C， Cheng Z X， et al. Production of oleanane-type sapogenin in transgenic rice via expression of β-amyrin synthase gene from Panax japonicus C. A. Mey[J].BMC Biotechnol， 2015， 15 （17）：45.

[107] Zhao S C， Park C H， Li X H， et al. Accumulation of rutin and betulinic acid and expression of phenylpropanoid and triterpenoid biosynthetic genes in mulberry （Morus alba L.）[J].J Agric Food Chem， 2015， 63 （23）： 8622.

[108] Biazzi E， Carelli M， Tava A， et al. CYP72A67 catalyzes a key oxidative step in Medicago truncatula hemolytic saponin biosynthesis[J]. Mol Plant， 2015， 8 （3）： 1493.

[109] Dai L H， Liu C， Zhu Y M， et al. Functional characterization of cucurbitadienol synthase and triterpene glycosyltransferase involved in biosynthesis of mogrosides from Siraitia grosvenorii[J].Plant Cell Physiol， 2015， 56（6）：1172.

[110] Huang Z W， Lin J C， Cheng Z X， et al. Production of dammarane-type sapogenins in rice by expressing thedammarenediol-Ⅱ synthase gene from Panax ginseng C.A. Mey[J]. Plant Sci， 2015， 239 （3）：106.

[111] Zhao F L， Bai P， Liu T， et al. Optimization of a cytochrome P450 oxidation system for enhancing protopanaxadiol production in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Bioeng， 2016， 9999： 1.

[112] Martin V J J， Pitera D J， Withers S T， et al. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids[J].Nat Biotechnol，2003， 21 （7）： 796.

[113] Ignea C， Athanasakoglou A， Ioannou E et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2015， doi/10.1073/pnas.1523787113.

[責任編輯 呂冬梅]