京大戟醋制前后對斑馬魚胚胎的急性毒性研究

張楷承+曹雨誕+姚芳+張麗+丁安偉

[摘要] 采用模式生物斑馬魚的胚胎評價京大戟醋制前后各提取物急性毒性，同時以大戟二烯醇為對照品測定了各提取物的總萜含量。選取24 h發育正常的斑馬魚胚胎，每個提取物設8個濃度和一個空白對照組，并觀察給藥后96 h斑馬魚胚胎的發育和死亡情況，計算不同樣品對斑馬魚胚胎的半數致死濃度（LC₅₀）。結果顯示對于斑馬魚胚胎，京大戟醋制前后各提取物均有急性毒性，與生品相比，醋制后毒性顯著降低。不同提取方式中，醇提物毒性大于水提物；不同極性部位中毒性大小依次為石油醚>二氯甲烷>乙酸乙酯>正丁醇、剩余部位。結合萜類成分含量測定結果可推測萜類成分為京大戟主要毒性成分，且其毒性大小與萜類成分的含量呈正相關。表明斑馬魚胚胎模型適用于京大戟毒性評價，為進一步認識與評價京大戟的毒性成分及醋制減毒的作用機制提供合適的研究方法以及理論依據。

[關鍵詞] 京大戟； 醋制； 斑馬魚胚胎； 急性毒性； 總萜含量

[Abstract] The embryos of model organism zebrafish were used to evaluate the acute toxicity of the extracts of Euphorbiae Pekinensis Radix and vinegar-processing Euphorbiae Pekinensis Radix， and the total terpene content of each extract was determined by using euphol as the reference standards. Twenty-four h normally developed zebrafish embryos were chosen， and 8 concentrations were adopted for each extract. Then the growth and death of zebrafish embryos were observed at 96 h after administration， and median lethal concentrations （LC₅₀） of the different samples on zebrafish embryos were calculated. The results showed that all of the extracts （before and after vinegar processing） had acute toxicity on zebrafish embryos. The toxicity of vinegar-processing Euphorbiae Pekinensis Radix was significantly lower than that of crude Euphorbiae Pekinensis Radix. Among different extraction methods， ethanol extract was more poisonous than water extract； in different polarity fractions， the toxicity was in the following order： petroleum ether>dichloromethane>ethyl acetate>n-butyl alcohol and remaining part. Combined with the results of the determination of terpene components， it can be concluded that the terpenoids are the main toxic components of Euphorbiae Pekinensis Radix， positively correlated with toxicity degree. It indicates that the zebrafish embryo model is appropriate for the toxicity evaluation of Euphorbiae Pekinensis Radix and provides appropriate research methods and theoretical basis for the further study of the toxic components and the mechanism of reducing toxicity.

[Key words] Euphorbiae Pekinensis Radix； processing with vinegar； zebrafish； acute toxicity； content of total terpene

斑馬魚Barchydanio rerio，為鯉科Danio屬，最早產于孟加拉、印度等地。因其與人類基因具有高度同源性，在蛋白質水平上其關鍵部位的同源性幾乎是100%，且各個器官如肝、腸、腎等都與人類極為相似，故可用斑馬魚模擬人類很多疾病[1-2]，作為一種新興的模式生物，斑馬魚有著低成本、易飼養、易于給藥與觀察、實驗動物數量多、重復性好等優點，近年來已經發展成為全球公認的醫學和毒理學動物模型 [3-5]，且斑馬魚胚胎毒性研究已經延伸到了中藥領域，并取得了喜人成果[6-9]。

京大戟為大戟科Euphorbiaceace大戟屬Euphorbia植物大戟E. pekinensis Rupr.的干燥根[10]，始載于《神農本草經》，列為下品，為中醫常用的峻下逐水藥，常用于水腫脹滿、胸腹積水等癥[11]。因其藥性苦寒有毒，故臨床多使用其醋制品，但現代研究尚不能明確闡述京大戟醋制減毒的原理[12]。經毒性實驗表明，醋制后京大戟的藥性緩和，刺激性毒性顯著降低[13]，現代化學成分研究發現，京大戟主要含有萜類等化學成分[14]。現有報道多以小鼠、細胞等手段探究京大戟的毒性，本課題組前期研究表明京大戟對于小鼠肝、胃、腸均有一定的毒性[15-16]，但動物實驗成本較高、時間較長、藥物用量大、不易重復；中醫藥理論強調用藥的整體作用，而體外細胞實驗不能夠完全模擬生物體內環境且實驗條件要求較高，與整體動物相比較為局限和片面。故本文擬以模式生物斑馬魚胚胎對京大戟醋制前后不同提取物進行毒性研究，同時測定各提取物中總萜的含量，以期對京大戟醋制減毒的物質基礎研究提供依據。

1 材料

1.1 藥材

京大戟購于廣西（20160616），經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定為大戟科植物京大戟E. pekinensis的塊根。

1.2 動物

實驗用魚為野生型AB品系斑馬魚[體長（3.5±0.3） cm，體重（0.45±0.1） g]，購于南京堯順禹生物科技有限公司，約7月齡，斑馬魚成魚在（28.5±0.5） ℃的水中自然交配繁殖魚卵，養殖與繁殖方法參照zebrafish book[17]。

1.3 儀器與試劑

桌上型連續投料粉碎機（AH-8111型，北京鑫環亞科技有限公司）；體式顯微鏡（SZX41型，上海明茲精密儀器有限公司）；智能生化培養箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠），UV-2401可見紫外分光光度計（島津公司）；電熱鼓風干燥箱；旋轉蒸發儀（BUCHI公司）；電子天平（梅特勒MS-105DV，1/10 萬）；超聲波清洗儀（KH-500型，昆山禾創超聲儀器有限公司）；人工海水（蒸餾水，NaCl 13.7 mmol·L^-1，KCl 5.4 mmol·L^-1，Na₂HPO₄0.25 mmol·L^-1，KH₂PO₄0.44 mmol·L^-1，CaCl₂1.3 mmol·L^-1，MgSO₄1.0 mmol·L^-1，NaHCO₃4.2 mmol·L^-1）；DMSO（批號2010307，分析純，南京化學試劑有限公司）；大戟二烯醇（實驗室自制，純度大于98%）；香草醛（阿拉丁試劑有限公司，質量分數為99%，批號43885）；冰醋酸（批號20160415，分析純，太倉滬試試劑有限公司）；高氯酸（批號20150606，優級純，上海金鹿化工有限公司）；甲醇（批號170765，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 生京大戟的制備 取京大戟藥材，除去雜質，洗凈，加水潤透，切厚片，干燥即為生京大戟飲片。

2.1.2 醋京大戟的制備 據《中國藥典》2015年版[11]，取凈生京大戟（SJDJ）1 kg加食醋300 g，悶潤2 h，加水稀釋至1 500 mL，悶潤2 h，文火煮沸至醋吸凈，取出，涼至六七成干，40 ℃減壓干燥8 h，得京大戟醋制品（CJDJ）。

2.1.3 生京大戟各溶劑提取物的制備 稱取京大戟生品50 g，洗凈，粉碎過4號篩，以10倍量乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇至無醇味，得到京大戟生品醇提浸膏（SCT），得率為12.91%。同樣按照上述方法，制備京大戟生品水提物得率為59.36%[用10倍量水回流提取2次，濃縮得到京大戟生品水提浸膏（SST）]。

醋京大戟各提取物的制備方法同上。醇提物（CCT）得率為13.06%，水提物（CST）為45.12%。

2.1.4 生京大戟不同提取部位的制備 稱取京大戟生品500 g，洗凈，粉碎過篩4號，以10倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇得京大戟生品醇浸膏，將浸膏用水懸浮，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取并回收溶劑得以上4個部位以及剩余部位。得率分別為石油醚（SPet）2.49%、二氯甲烷（SE）1.18%、乙酸乙酯（SY）4.59%、正丁醇（SZ）2.59%、剩余（SS）1.49%。

醋京大戟不同部位的制備同上。各極性部位得率分別為石油醚（CPet）2.70%、二氯甲烷（CE）1.38%、乙酸乙酯（CY）3.06%、正丁醇（CZ）3.50%、剩余（CS）4.80%。

2.2 總萜類含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取大戟二烯醇對照品6.06 mg至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，即為大戟二烯醇對照品溶液。

2.2.2 供試品的制備 精密稱取SCT 12.91 mg，CCT 13.06 mg，至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻。SST 59.36 mg、CST 45.12 mg，至10 mL量瓶中，加蒸餾水溶解，混勻。分別取SPet，SE，SY，SZ，SS 10 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻；醋品各極性部位供試品制備同上。

2.2.3 顯色條件與吸收波長的確定 精密量取對照品對照品0.5 mL和SCT供試品0.25 mL于具塞試管中，置水浴鍋揮干溶劑，加入0.5 mL新鮮配制的0.5%香草醛-冰醋酸溶液以及高氯酸0.6 mL，混勻后100 ℃水浴30 min，取出冷卻后精密加入冰醋酸5 mL，搖勻即得待測樣品溶液。以相應的試劑作為空白，在400～800 nm處進行掃描[18]。根據掃描結果，選用540 nm為測定波長。

2.2.4 線性關系考察 分別精密量取大戟二烯醇對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，按照上述顯色條件顯色，同法制備空白溶液，參照分光光度法在540 nm處測定其吸光度。以樣品吸光度（y）為縱坐標，大戟二烯醇的取樣量（x，mg）為橫坐標，進行線性回歸。

2.2.5 精密度試驗 取SCT供試品適量，按照上述條件顯色后，與540 nm處連續測定6次，計算RSD。

2.2.6 重復性試驗 精密量取6份SCT，每份0.25 mL，加入具塞試管中，顯色后于540 nm處測定吸光度，計算RSD。

2.2.7 穩定性試驗 精密量取SCT 0.25 mL，顯色后每隔一段時間測定一次吸光度，共測定6次，計算RSD。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取CPet部位供試品6份，每份1 mL，并向其中加入大戟二烯醇對照品溶液（0.121 2 g·L^-1）0.4 mL，水浴揮干溶劑后顯色，于540 nm處測定其吸光度，計算平均回收率以及RSD。

2.3 斑馬魚毒性評價

2.3.1 斑馬魚胚胎繁殖及收集 需要產卵前一周提前將雌雄斑馬魚按照1∶2的比例分開喂養，產卵前一晚將其合并，撈入特制的產卵容器中，放入氧氣泵以及加熱棒，控制溫度（28.5±0.5） ℃，第2天撈出成魚，收集魚卵，清洗并除去未受精的死卵以及糞便等雜物。魚卵采用人工海水培養，于培養箱中培養24 h，挑取健康發育的受精卵用于實驗。

2.3.2 DMSO對斑馬魚的急性毒性 由于斑馬魚胚胎無法口服給藥，故需將樣品溶解于培養胚胎的人工海水中，從而使得斑馬魚胚胎自主的從水中吸收待測藥物。京大戟提取物中的萜類成分等不易溶于水，故實驗中采用二甲基亞砜（DMSO）助溶，而DMSO也具有毒性，因此有必要對其毒性進行評價，從而消除DMSO對于實驗的影響。

實驗方法采用靜水實驗法，以96 h為1個試驗周期。采用24孔板，每孔放入10枚健康斑馬魚胚胎，用滴管將孔中的水吸去，分別加入不同濃度（0.1%，0.2%，0.4%，0.8%，1%，2%，4%）的DMSO人工海水溶液2 mL，每個濃度設置1個平行組與1個人工海水對照組，給藥后觀察96 h內胚胎的發育以及死亡情況。得出DMSO對斑馬魚的中毒劑量。

2.3.3 預實驗確定毒性范圍 將京大戟醋制前后各提取物用人工海水溶解（如需助溶，則加入不超過0.5%DMSO），配制成濃度不同的一系列樣品（不同提取方式各樣品濃度均為所含生藥量，各極性部位樣品濃度均為浸膏濃度），加入放有10枚健康斑馬魚胚胎的24孔板中，每孔2 mL，每個濃度設置3個平行組與1個對照組，給藥后每隔24 h觀察并記錄胚胎的發育及死亡情況，4 d后得出各提取物96 h的LC₁₀₀和LC₀。

2.3.4 LC₅₀的測定 將各供試品按照預實驗給定的LC₁₀₀和LC₀的范圍，在其中選定組間比例為0.8，按照幾何級數梯度設8個實驗濃度組以及1個人工海水對照組。每個濃度組設定3個平行組以及1個對照組。實驗期間每24 h觀察魚卵的孵化及死亡情況并及時記錄，整個實驗周期結束后，將數據進行統計分析，計算京大戟各提取物對斑馬魚的半數致死濃度（LC₅₀）。

2.3.5 數據處理 實驗結果采用 SPSS Statistics 20軟件進行統計分析，數據用±s表示，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

3 結果

3.1 京大戟總萜含量測定

3.1.1 方法學考察 線性關系考察中經過線性回歸得回歸方程y= 5.735x-0.020 2（r=0.999 5）。表明該方法線性關系良好；精密度實驗中計算得RSD為0.30%，表明該方法精密度良好；重復性實驗中計算得RSD為2.0%，表明該方法重復性良好；穩定性實驗中計算得RSD為1.8%，表明樣品穩定性良好，在12 h內保持穩定；加樣回收率實驗中計算得平均回收率為100.7%；RSD為1.5%。表明本方法準確可行。

3.1.2 京大戟醋制前后各樣品總萜含量測定 將京大戟各樣品按照上述方法進行顯色，得到樣品溶液，測定吸光度后計算總萜含量，結果見表1。

3.2 DMSO對斑馬魚毒性實驗

DMSO對斑馬魚急性毒性實驗結果見表2，可見DMSO質量濃度在0.5%之內對斑馬魚96 h不產生急性毒性反應，可以安全使用。

3.3 各提取物對斑馬魚急性毒性預實驗

經過預實驗，得到京大戟醋制前后的不同提取物在96 h對斑馬魚胚胎的無死亡的最大劑量（LC₀）和全部死亡的最小劑量（LC₁₀₀），結果見表3。

預實驗得到京大戟生醋不同溶劑提取部位對斑馬魚的LC₀和LC₁₀₀，結果見表4。

3.4 京大戟醋制前后不同提取物對斑馬魚胚胎96 h的LC₅₀

各組斑馬魚胚胎給藥后，每隔24 h觀察死亡情況并及時挑出死亡的胚胎，記錄數據，96 h實驗結束，統計死亡情況，計算得到各樣品對斑馬魚的LC₅₀。結果表明，與生品相比，醋制后各提取物均有LC₅₀有明顯升高（P<0.01），表明醋制后毒性顯著減小；對于不同提取方式，生品與醋品的水提物毒性明顯減小與醇提物；不同極性部位中，極性較小的石油醚、二氯甲烷部位毒性最強，其余部位的LC₅₀均有明顯升高（P<0.01），可推測京大戟中極性較小的化合物毒性較大。京大戟醋制前后不同提取物LC₅₀的測定具體結果見表5，圖1；不同極性部位結果見表6，圖2。

x

3.5 京大戟醋制前后不同提取物對斑馬魚胚胎的量-毒關系

上述實驗得到的不同濃度的京大戟生品醇提物對斑馬魚的毒性情況，以藥液濃度 （mg·L^-1）為橫坐標，斑馬魚的死亡率（%）為縱坐標繪圖。可以得到京大戟醋制前后不同提取物的量-毒曲線，見圖3。按照同樣的方法得到京大戟醋制前后醇提物不同溶劑提取部位的量-毒曲線，見圖4。結果表明京大戟醋制前后各提取物對斑馬魚胚胎均有明顯的量毒關系。

4 討論

京大戟作為常用有毒中藥，因其苦寒有毒，醋制機制又尚不明確，一直以來嚴重制約其發展和臨床使用。因此，運用現代科學手段闡述京大戟的毒性成分、作用機制以及醋制減毒的原理，成為了京大戟研究的重點。斑馬魚作為一種新的模式生物，比細胞以及小鼠等傳統實驗手段有其獨特的優勢，如高通量、低成本、易觀察、給藥量少、重復性好等[19-20]，本實驗中使用斑馬魚胚胎對各提取物進行LC₅₀的測定，相比于小鼠，斑馬魚胚胎的數量較多，在數據基數大的情況下，實驗結果相對更加穩定可靠，且大大節約了時間以及成本。李興華等[21]采用小鼠測定京大戟生品不同提取物的LC₅₀，由于小鼠個體較大，耐受性較強，只能測定醇提物，而水提物急性毒性無法測出；對于不同極性部位，本文采用斑馬魚胚胎，毒性評價結果與王奎龍等[22]使用小鼠測定的毒性大小相一致，表明斑馬魚胚胎可以代替小鼠，更加方便快捷的對京大戟的毒性進行評價。同時在實驗過程中，胚胎完全透明，可以在顯微鏡下觀察其孵化以及發育情況，與空白組相比，給藥組尤其是毒性較大的石油醚、二氯甲烷部位，胚胎發育明顯遲緩，且表現出卵黃囊吸收延遲、肝臟以及胃腺腸道發育不良、血流速度減緩、心包水腫等癥狀，表明京大戟毒性成分對于斑馬魚胚胎有明顯的發育毒性，且對肝、胃腸、心臟等均具有一定毒性，而后期研究京大戟毒性成分的作用部位以及作用機制時優勢將更加明顯。

綜合斑馬魚毒性評價與含量測定2個方面的結果，可知京大戟中的毒性成分主要集中在石油醚、二氯甲烷部位，而且經過醋制，這2個部位中萜類成分的含量下降也最明顯，因此可通過分離這2個部位中的化合物，來進一步確定京大戟中的毒性成分。京大戟在醋制過程中，加入了醋并且與水共煮，期間可能發生酸水解等其他化學反應，導致毒性成分化學結構發生改變，從而降低了毒性。故可采用醋酸酸水解等方法，將毒性成分進行轉化并與醋京大戟成分進行比對，對醋制中成分轉化的過程進行追蹤，從而進一步闡明京大戟毒性的物質基礎以及醋制減毒機制。同時也為以斑馬魚為動物模型進行生物活性導向分析毒性及有效成分提供新思路。

[參考文獻]

[1] 彭蘊茹， 韋英杰， 丁永芳， 等. 基于斑馬魚模型的藥物毒性研究進展與中藥毒性研究新策略[J]. 中草藥， 2017， 48（1）： 17.

[2] 舒斌， 韋英杰， 張陸勇， 等. 采用模式生物斑馬魚評價三種中藥成分的急性毒性[J]. 云南中醫學院學報， 2010， 33（1）： 35.

[3] 梁愛華. 斑馬魚——一種可用于中藥藥效和毒性篩選的魚類模型[J]. 中國中藥雜志， 2009， 34（22）： 2839.

[4] 常嘉， 陸亮， 王慶利， 等. 斑馬魚在藥物早期毒性篩選中的應用進展[J]. 中國新藥雜志， 2013（13）： 1500.

[5] 許冰潔， 張立將， 李春啟， 等. 斑馬魚胚胎評價5種藥物的發育毒性與模型驗證[J]. 中國藥理學通報， 2016（1）： 74.

[6] 陳建明， 何月平， 張玨鋒， 等. 夾竹桃葉乙醇提取物對斑馬魚的毒性評價[J]. 水生生物學報， 2011， 35（5）： 835.

[7] 楊雨婷， 何育霖， 張雪， 等. 廣藿香油及其主要成分對斑馬魚胚胎發育毒性的比較研究[J]. 中國民族民間醫藥， 2015（21）： 14.

[8] 姜瑋， 王新敏， 唐于平， 等. 甘遂不同提取物對斑馬魚急性毒性的初步觀察[J]. 南京中醫藥大學學報， 2012， 28（1）： 53.

[9] 曹雨誕， 李征軍， 陳海鷹， 等. 甘遂不同炮制品及提取物對斑馬魚的急性毒性研究[J]. 中國現代應用藥學， 2013， 30（2）： 140.

[10] 中華本草編委會.中華本草精選本.第4卷[M]. 上海： 上海科學技術出版社， 1999： 806 .

[11] 中國藥典. 一部[S]. 2015： 269.

[12] 張樂林， 葛秀允， 孫立立， 等. 醋制對京大戟毒性和藥效的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2013， 19（19）： 276.

[13] 葛秀允， 孫立立， 張樂林. 醋制對京大戟刺激性毒性作用的影響[J]. 中國醫院藥學雜志， 2015， 35（5）： 380.

[14] 王寶麗， 鄒迪新， 程錢， 等. 京大戟化學成分及藥理作用研究概述[J]. 環球中醫藥， 2016， 9（7）： 896.

[15] 曹雨誕， 顏曉靜， 張麗， 等. 醋制降低京大戟對大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6毒性研究[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（6）： 1069.

[16] 曹雨誕， 陳海鷹， 張麗， 等. 醋制降低京大戟細胞毒性部位對小鼠肝臟氧化損傷機制研究[J]. 中國藥理學通報， 2014， 30（2）： 295.

[17] Westerf Ield M. The zebrafish book[M]. Eugene：Eugene university of Oregon press，1995.

[18] 賈云云， 羅士香. 京大戟中萜類含量測定[J]. 亞太傳統醫藥， 2015， 11（10）： 38.

[19] 施展. 斑馬魚——一只游入人類新藥研發領域的小魚[J]. 世界最新醫學信息文摘：連續型電子期刊， 2016， 16（20）： 29.

[20] 趙崇軍， 田敬歡， 王金鳳， 等. 斑馬魚在中藥研究中的應用進展[J]. 中草藥， 2015， 46（17）： 2635.

[21] 李興華， 鐘麗娟， 王晶晶. 京大戟與紅大戟的急性毒性和刺激性比較研究[J]. 中國藥房， 2013， 24（3）： 208.

[22] 王奎龍， 郁紅禮， 吳皓， 等. 京大戟毒性部位及其醋制前后成分變化研究[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（23）： 4603.

[責任編輯 孔晶晶]