桑椹多糖的結構表征及其對乙醇脫氫酶活性的影響研究

王杏+鄧青芳+陳華國+周欣

[摘要] 該實驗采用回流法提取桑椹多糖，經脫蛋白及DEAE-Cellulose 52分離純化得到4種多糖組分（中性多糖MFP-1，微酸性多糖MFP-2，酸性多糖MFP-3和MFP-4）。通過化學法和儀器分析法對各多糖組分進行理化性質測定和結構表征，并研究其對乙醇脫氫酶（ADH）活性的影響。結果表明，MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4中的多糖量分別為75.3%，83.7%，79.1%，74.3%，其平均相對分子質量分別為112.2，128.8，199.5，181.9 kDa。MFP-1主要含有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖（26.8∶20.4∶8.7∶5∶1）；MFP-2主要含有阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸（34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1）；MFP-3主要含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖（28.3∶22.6∶20.9∶18.6∶12.5）；MFP-4主要含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸（47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1）。紅外光譜分析結果表明，MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4中均有多糖的特征吸收峰，其中MFP-3和MFP-4是以β苷鍵為主的吡喃型多糖?；钚越Y果表明，4種多糖對ADH均有激活作用，其ADH激活能力順序為：聯苯雙酯>MFP-3>MFP-1>MFP-2>硫普羅寧>MFP-4，MFP-1，MFP-2和MFP-3對ADH的激活作用均大于陽性對照硫普羅寧，同時發現MFP-3對ADH的激活效果與陽性對照聯苯雙酯的激活效果相當，推測其與之連接的糖醛酸種類有關，這為桑椹多糖的“構-效”研究提供參考依據。

[關鍵詞] 桑椹多糖； 理化性質； 結構表征； ADH活性

[Abstract] Mori Fructus polysaccharides （MFPs） have been used as a source of therapeutic agents. The most promising activities of these biopolymers are their immunomodulation and anti-cancer effects. It was reported that polysaccharides were a potential drug against liver injury， but the hepatoprotective effect of MFPs was ambiguous. In this study， the fractionation of crude polysaccharides on DEAE-Cellulose 52 gave four fractions （MFP-1， MFP-2， MFP-2 and MFP-4）. The results showed that the contents of carbohydrates were 75.3%， 83.7%， 79.1%， 74.3%， and the molecular weight of them were 112.2， 128.8， 199.5， 181.9 kDa. Monosaccharide component analysis indicated that MFP-1 was composed of galactose， glucose， arabinose， rhamnose and mannose with the molarity rate of 26.8∶20.4∶8.74∶5∶1； MFP-2 contained arabinose， galactose， rhamnose， glucose and galacturonic acid with the molarity rate of 34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1； MFP-3 was composed of galacturonic acid， galactose， glucose， rhamnose and arabinose with the molarity rate of 28.3∶22.6∶20.9∶18.6∶15.1； MFP-4 contained glucose， galactose， rhamnose， galacturonic acid， arabinose and glucuronic acid with the molarity rate of 47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1. IR analysis′s results indicated that MFP-3 and MFP-4 may be polysaccharides containing β-glycosides. The alcohol dehydrogenase （ADH） activity text showed that， all these four MFPs were found have a positive effect on the activity of ADH， with order： bifendate>MFP-3>MFP-1>MFP-2>tioprnin>MFP-4， and the MFP-3 had the highest activity and demonstrated outstanding hepatic protecting activity.

[Key words] Mori Fructus polysaccharides； physic-chemical characters； characterization； activity effect of ADH

據2015年版藥典記載[1]，桑椹具有滋陰補血、生津潤燥的藥效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、心悸失眠、須發早白、津傷口渴、內熱消渴、腸燥便秘等。此外，還有少量文獻報道[2]桑椹對酒精/四氯化碳所致的肝損傷有潛在的保護作用，國家已把桑椹列為藥食同源的保健品行列。

桑椹多糖（Mori Fructus polysaccharides，MFPs）是從桑樹果實中得到的具有抗氧化、降血糖、抗疲勞等[3-4]生物活性的一類高分子化合物。文獻報道[5]，桑椹多糖可提高妊娠小鼠的脾臟和胸腺指數、腹腔巨噬細胞的吞噬能力和速度，促進淋巴細胞轉化和綿羊紅細胞所致的小鼠抗體生成，增強小鼠遲發性過敏反應強度，改善妊娠小鼠免疫功能。

乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是參與乙醇體內代謝的主要酶，可抑制人體對乙醇的吸收，加強乙醇在胃腸道的首過效應，從而減輕乙醇對人體消化系統、肝臟系統及神經系統的損害，起到有效的解酒護肝作用[6]。

由于多糖的相對分子質量大、黏度高、結構復雜等因素，不利于對其進行結構表征的研究和進一步“構-效”關系的探索。據文獻報道[7]，多糖是潛在的抗肝損傷藥物制劑，但桑椹多糖的抗肝損傷作用尚不明確。因此，本研究從桑椹中分離純化得到4種多糖，通過理化性質、單糖組成、紅外光譜（FT-IR）分析等手段對其進行結構表征，并通過考察4種多糖對ADH活性的影響，探索桑椹多糖的解酒作用，為其在肝損傷方面的活性研究提供科學依據，也為桑椹多糖的“構-效”關系研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1/10萬電子分析天平（XS105DU），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酶標儀（Max Plus 384），美國Moleaular Devices公司；紅外光譜儀（TENSOR27），德國Bruker公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260），安捷倫科技有限公司；冷凍干燥機（FD-80），北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 試劑

二乙氨基乙基纖維素52（DEAE-Cellulose 52），Sigma公司；葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、甘露糖（mannose，Man）、木糖（xylose，Xyl）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalUA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）對照品，均購于貴州迪大生物有限公司；氧化型輔酶 Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺），Roche公司；乙醇脫氫酶，Sigma公司；聯苯雙酯、硫普羅寧，中國食品藥品檢定研究院；考馬斯亮藍G-250，上海藍季生物有限公司；1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP），天津市科密歐化學試劑有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），天津市光復精細化工研究所；苯酚、濃硫酸、乙醇，均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 桑椹多糖的提取 取一定量的桑椹鮮果，勻漿，加水回流處理2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，Sevag法[8]對濃縮液進行脫蛋白處理，取上層液，邊振搖邊緩慢加入適量的95%乙醇，使乙醇終體積分數達到80%，4 ℃冷藏24 h，離心（3 500 r·min^-1，15 min），取沉淀復溶，再次醇沉，重復3次，真空冷凍干燥，即得桑椹粗多糖，于干燥罐保存，備用。

2.1.2 桑椹多糖的分離純化 配制10 g·L^-1的桑椹粗多糖溶液，離心（3 500 r·min^-1，10 min），取上清液20 mL經DEAE-Cellulose 52纖維素離子交換樹脂柱（3.2 cm×30 cm），依次用蒸餾水，0.1，0.3，0.5 mol·L^-1NaCl溶液分段洗脫（流速為2.5 mL·min^-1），每管收集10 mL，采用苯酚-硫酸法[9]對洗脫液跟蹤測定，直至無多糖洗出為止，按組分洗脫峰合并獲得不同組分，減壓濃縮，透析，真空冷凍干燥，得各組分桑椹多糖。

2.1.3 桑椹多糖的理化性質 總糖含量的測定是以葡萄糖標準溶液為對照，采用苯酚-硫酸法測定總糖的含量。蛋白質含量的測定是以牛血清白蛋白標準溶液為對照，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量[10]。硫酸基含量的測定是以硫酸鉀標準溶液為對照，采用氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸基的含量[11]。糖醛酸含量的測定是以葡萄糖醛酸標準溶液為對照，采用硫酸-咔唑法測定糖醛酸的含量[12]。

2.1.4 單糖組成分析 采用PMP柱前衍生化HPLC色譜[13]。樣品的處理：稱取15 mg各組分多糖樣品，分別加入2 mol·L^-1TFA溶液6 mL，封口，105 ℃水解10 h，水解液蒸發至干，再反復加入甲醇，蒸干，除去多余的TFA，加入少量水溶解，得完全酸水解溶液，備用。

取完全酸水解溶液和對照品（Rha，Glc，Man，Xyl，Gal，GlcUA，GalUA，Ara）各1 mL，依次加入1.2 mL PMP溶液和0.3 mol·L^-1NaOH溶液1 mL，70 ℃水浴1 h，冷卻至室溫后加入0.3 mol·L^-1HCl溶液1 mL中和NaOH溶液，加入二氯甲烷除去多余的PMP，離心（3 500 r·min^-1，10 min），取上清液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，得衍生化的樣品和對照品溶液。

色譜條件，色譜柱為ZORBOX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相磷酸鹽緩沖液pH 7.4（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～28 min，13%～19% B；28～38 min，19%～16% B；38～50 min，16%～25% B）；柱溫30 ℃；流速1 mL·min^-1；進樣量2 μL；檢測波長250 nm。

2.1.5 紅外分析 分別取1～2 mg干燥的各組分桑椹多糖，與100 mg干燥的KBr晶體混合，研細后壓片，在400～4 000 cm^-1進行紅外掃描。

2.1.6 相對分子質量分析 將不同相對分子質量的葡聚糖對照品（Mw=70，130，175，300，256，580 kDa）配制成5 g·L^-1溶液，由小分子到大分子依次進樣，記錄各對照品相應的保留時間，以保留時間為橫坐標，以相對分子質量的對數為縱坐標繪制標準曲線。

色譜條件，色譜柱為Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）；流動相 0.1 mol·L^-1NaNO₃；柱溫 40 ℃；流速 0.6 mL·min^-1；進樣量 20 μL；檢測器為示差檢測器；檢測溫度 55 ℃。將各組分桑椹多糖配制成5 g·L^-1溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，操作條件同上，然后根據MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4的保留時間計算其相對分子質量。

2.1.7 桑椹多糖各組分對ADH活性的影響 采用改良后的瓦勒-霍赫（Valle & Hoch）法[14]檢測ADH活性，在測定板中依次加入100 μL焦磷酸鈉緩沖液（pH 8.8），75 μL NAD⁺，35 μL乙醇，10 μL各組分桑椹多糖溶液和陽性對照溶液，混合后37 ℃加蓋溫育5 min。立即加入10 μL ADH，搖勻后立即測定340 nm處的吸光度（A₃₄₀），每隔10 s讀數1次，連續測定5 min，記錄數據。以蒸餾水代替乙醇溶液調零點，以不加藥物組為空白組，以硫普羅寧和聯苯雙酯為陽性對照。采用以下公式計算ADH活性和激活率。

2.2 結果與討論

2.2.1 桑椹多糖分離純化 桑椹多糖經DEAE-Cellulose 52分離得到4種多糖組分，分別為中性多糖MFP-1，微酸性多糖MFP-2，酸性多糖MFP-3和MFP-4，見圖1。

2.2.2 桑椹多糖理化性質 MFP-2的總糖含量最高，與上述洗脫曲線結果一致，見表1。各組分均存在一定量的蛋白質，推測這些組分可能是糖蛋白結合物。其中MFP-1含有少量的硫酸基和糖醛酸，表明MFP-1基本上為一些中性多糖。相反的，MFP-3和MFP-4中含有糖醛酸較多，表明這2種組分可能是一些果膠物質。

2.2.3 單糖組成分析 桑椹多糖各組分的單糖組成結果，見圖2，MFP-1主要含有Gal，Glc，Ara，Rham，Man，其摩爾比為26.8∶20.4∶8.7∶5∶1；MFP-2主要含有Ara，Gal，Rham，Glc，GalUA，其摩爾比為34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1；MFP-3主要含有GalUA，Gal，Glc，Rham，Ara，其摩爾比為28.3∶22.6∶20.9∶18.6∶12.5；MFP-4主要含有Glc，Gal，Rham，GalUA，Ara，GlcUA，其摩爾比為47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1。由結果可知，MFP-1中主要由5種中性單糖組成，這與上述結果MFP-1為中性多糖一致。值得注意的是，MFP-3和MFP-4除了含有半乳糖醛酸和半乳糖等單糖外，還含有一定比例的葡萄糖，這個結果與文獻報道的果膠的理化性質（一般果膠物質含有很少比例的葡萄糖）有較大的差異[15]。

2.2.4 紅外分析 MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4均出現了多糖特征吸收峰，4種多糖均在3 400 cm^-1附近出現較強的寬吸收峰，應是糖類的O-H和蛋白質的N-H伸縮振動，說明多糖存在分子間或分子內氫鍵；在2 925，2 930，2 935，2 944 cm^-1附近出現了弱吸收峰，是糖類不對稱C-H伸縮振動；在1 615，1 636，1 635 cm^-1處出現寬吸收峰是-COO-非對稱伸縮振動，在1 415 cm^-1附近出現吸收峰，應是-COO-對稱伸縮振動；在1 300～1 000 cm^-1處出現吸收峰是吡喃環的伸縮振動，因此，可以推測4種多糖是吡喃環結構[16]，見圖3。MFP-3和MFP-4多糖在897 cm^-1處出現吸收峰，推測這2種多糖含有β-糖苷鍵[17]。

2.2.5 相對分子質量測定 根據標準多糖相對分子質量的計算公式lgMw =-0.41tR+6.77，其中tR為保留時間。在相同條件下測定MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4的相對分子質量，MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4的保留時間分別為11.512，11.366，10.902，11.000 min，將其代入標準回歸方程，得各多糖的平均相對分子質量分別為112.2，128.8，199.5，181.9 kDa。

2.2.6 各組分桑椹多糖對ADH的激活作用 由實驗結果可以得出，桑椹多糖分離的4種組分對ADH均有不同程度的激活作用。當ADH激活率為50%時，陽性對照（硫普羅寧，聯苯雙酯）及4種多糖（MFP-1，MFP-2，MFP-3，MFP-4）的質量濃度分別為16.7，9.3，14.1，16.6，10.3，18.6 mg·L^-1，ADH激活能力順序為聯苯雙酯>MFP-3>MFP-1>MFP-2>硫普羅寧>MFP-4，其中MFP-1，MFP-2和MFP-3對ADH激活作用均大于陽性對照硫普羅寧對ADH激活作用，并且MFP-3與陽性對照聯苯雙酯對ADH的激活作用相當，表明MFP-3具有很好的解酒護肝的應用前景。

3 討論

桑椹多糖經提取、除蛋白及純化，得到4組多糖（MFP-1，MFP-2，MFP-3和MFP-4），綜合上述結果，MFP-1屬于中性多糖，MFP-2屬于微酸性多糖，含有總糖量最高，MFP-3屬于酸性多糖，含有較多的糖醛酸，MFP-4屬于酸性多糖，含有的糖醛酸最高，并且這些多糖在除去游離蛋白后仍然檢測到含有少量蛋白質，說明這4種多糖可能是蛋白質的結合物。

柱前衍生化HPLC法，具有分離效果好、分析時間短、分析成本低和產物無立體結構等優點。本研究通過PMP柱前衍生化HPLC色譜、紅外光譜及高效凝膠滲透色譜對桑椹多糖各組分的單糖組成、結構及分子量測定。初步推測4種多糖是含有吡喃環的多糖，MFP-3和MFP-4是含有β-糖苷鍵和糖醛酸的多糖。

人體攝入乙醇后，90%～98%的乙醇在肝臟代謝，乙醇代謝的途徑之一是乙醇通過激活體內ADH，將乙醇轉化為乙醛，從而降低體內酒精含量。ADH激活率可能與多糖中單糖組成、苷鍵類型、連接順序、分枝情況、二級結構等有關。當ADH激活率為50%時，MFP-3的效果明顯高于陽性對照硫普羅寧，且與陽性對照聯苯雙酯的效果相當。結合桑椹多糖的理化性質、單糖組成和結構不同的分析，ADH激活率可能與各組分多糖中所含的單糖種類和比例有關。MFP-3中半乳糖醛酸的量為27.5%，比MFP-2與MFP-4中含半乳糖醛酸分別高出15.3%和8.7%，這說明ADH激活率可能與其糖醛酸的種類和糖醛酸連接位點有關，本實驗為研究多糖結構與ADH活性的關系奠定基礎。

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[責任編輯 丁廣治]