PLA—α—細辛腦納米粒經鼻腔、靜脈給藥后藥物動力學研究

陸瑾+郭立瑋+付廷明+朱國龍+戴真南+展冠軍+陳麗麗

[摘要] 采用乳化溶劑揮發法制備聚乳酸（PLA）-α-細辛腦納米粒，并與靜脈注射給藥比較，研究PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后藥物的體內分布及腦組織的靶向性。結果顯示：鼻腔給藥和靜脈注射后的腦靶向系數分別為1.65與1.16，PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后的絕對生物利用度為74.2%，腦靶向效率為142.24%，鼻-腦傳遞百分比為29.83%。熒光標記法顯示，PLA-α-細辛腦熒光納米粒經鼻腔給藥后，香豆素-6在腦組織中的熒光強度最大，達到腦靶向給藥的目的；PLA-α-細辛腦熒光納米粒靜脈注射給藥后，香豆素-6在肝組織中的熒光強度遠高于鼻腔給藥，表明PLA-α-細辛腦納米粒經鼻腔給藥可降低藥物導致的肝毒性。此外，PLA-α-細辛腦熒光納米粒經鼻腔給藥后，香豆素-6在肺組織中的熒光強度較弱，解決了氣流粉碎法制備的α-細辛腦干粉經鼻腔給藥到達肺部量較多的缺點。體內研究表明：與靜脈注射相比，PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后的腦靶向性優于靜脈注射。

[關鍵詞] PLA-α-細辛腦納米粒； 鼻腔； 藥物動力學； 腦靶向

[Abstract] PLA-α-asarone nanoparticles were prepared by using organic solvent evaporation method， and their in vivo distribution and brain targeting after intranasal administration were studied as compared with intravenous administration. The results showed that brain targeting coefficient of PLA-α-asarone nanoparticles after intranasal and intravenous administration was 1.65 and 1.16 respectively. The absolute bioavailability， brain-targeting efficiency and the percentage of nasal-brain delivery of PLA-α-asarone nanoparticles were 74.2%， 142.24 and 29.83%， respectively after intranasal administration. The results of fluorescence labeling showed that the fluorescent intensity of coumarin-6 in the brain tissue was the highest after intranasal administration of PLA-α-asarone fluorescent nanoparticles， achieving the purpose of brain-targeted drug delivery. The fluorescent intensity of coumarin-6 in liver tissue after intravenous administration of PLA-α-asarone nanoparticles was much higher than that after intranasal administration， indicating that intranasal administration of PLA-α-asarone nanoparticles could decrease drug-induced hepatotoxicity. In addition， the fluorescent intensity of coumarin-6 in lung tissue was weaker after intranasal administration， which solved the shortcomings of intranasal administration of α-asarone dry powder prepared by airflow pulverization method. In vivo studies indicated that PLA-α-asarone nanoparticles after intranasal administration had a stronger brain targeting as compared with intravenous administration.

[Key words] PLA-α-asarone nanoparticles； intranasal； pharmacokinetic； brain targeting

α-細辛腦是天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的主要活性成分之一，研究報道：α-細辛腦通過作用于NO水平治療阿爾茨海默病[1]，通過抑制海馬神經元的活性及γ-氨基丁酸（GABA）受體的表達[2]治療癲癇，同時其可透過血腦屏障。因此，α-細辛腦具有治療中樞性神經系統疾病的前景。目前，α-細辛腦主要有2種給藥方式，以膠囊劑或片劑的形式給藥，生物利用度分別僅有2.73%，5.56%[3]；若采用靜脈注射給藥，由于α-細辛腦較高的脂溶性使其在制備過程中加入了吐溫、丙二醇等助溶劑，而吐溫、丙二醇等助溶劑又是導致細辛腦注射液過敏性休克等嚴重不良反應的重要原因之一[4-5]。

納米粒作為膠態藥物載體具有小粒子的特征，可以穿過生物膜屏障，有的甚至可避免網狀內皮系統吞噬，在不增加藥物向血液轉運的情況下可促進藥物由鼻至腦的直接轉運，從而提高藥物的腦內濃度[6-8]。本課題組將α-細辛腦通過乳化溶劑揮發法將其制備成PLA-α-細辛腦納米粒，并對其進行了表征及鼻黏膜毒性的研究[9]。為評價藥物在體內的靶向性，本研究采用與靜脈注射對比的方式，進一步研究PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后α-細辛腦在體內的分布情況。

1 材料

SM-1000D超聲波細胞破碎儀（南京舜瑪儀器設備有限公司）；HJ-6A六聯數顯控溫磁力攪拌器（江蘇金運市金城國勝實驗儀器廠）；-70 ℃超低溫冰箱（海爾）；Allegra 64R高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；I-6冷凍干燥機（Ehrisa公司）；LibrorAEL-40SM 1/10萬電子天平（島津）；微型移液器（Eppendor公司）；MTN-2000W氮氣濃縮儀（奧特賽恩斯儀器有限公司）；KQ3200醫用數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；50 μL微量進樣針（濟南賽暢科學儀器有限公司）；WH-90A型微型混合器（上海亞榮生化儀器廠）；E6/10-8G型超細勻漿機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；ACQUITYTM UPLC超高效液相色譜系統，XevoTM TQ質譜系統（美國Waters公司）； ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；CRi Maestro IN-VIVO Imaging System小動物活體成像系統（美國）。

α-細辛腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100298-201203）；吲哚美辛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100258-200904）；α-細辛腦原料藥（湖北藝康源化工有限公司，批號130104，純度>98%）；聚乳酸（PLA，相對分子質量1萬，批號14011105，山東醫療器械研究所）；聚乙烯醇1788（polyvinyl alcohol，PVA1788，上海阿拉丁試劑有限公司）；香豆素-6（coumarin-6，Sigma-Aldrich）；甲醇（色譜純，Merck），冰醋酸（美國ROE scientific INC.，HPLC），正丁醇（上海中試化工總公司，AR，20090423），水為重蒸水，丙酮、二氯甲烷為分析純。

Sprague Dawley（SD）大鼠，體重200～250 g，雄性，SPF級（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司），許可證號SCXK（滬）2008-0016。大鼠飼養在SPF級的環境下，溫度18～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光照/黑暗交替，實驗前自由飲水飲食。

2 方法

2.1 PLA-α-細辛腦納米粒制備

精密稱取一定量α-細辛腦原料藥和PLA溶于10 mL的有機溶劑（二氯甲烷-丙酮=9∶1）中，配制成PLA質量濃度為14.76 g·L^-1，α-細辛腦藥物質量濃度為4.89 g·L^-1的有機相，將有機相用注射器緩緩注入20 mL不斷攪拌的濃度為1%的PVA水溶液中，滴畢，繼續攪拌2 min后于超聲波細胞破碎儀在600 W功率下超聲4 min，磁力攪拌器攪拌6 h以上揮去有機溶劑后，5 000 r·min^-1預離心5 min除去沉淀，離心液再以21 000 r·min^-1離心45 min得納米粒沉淀，該沉淀用重蒸水洗滌2次以除去PVA，適量水分散，冷凍干燥48 h得粉末狀樣品。臨用前使用重蒸水配成10 g·L^-1及50 mg·L^-1的混懸液，分別供鼻腔給藥及尾靜脈注射。通過該方法制備得到的PLA-α-細辛腦納米粒平均粒徑為265.4 nm，PDI指數0.038，載藥量12.40%，包封率55.86%。

2.2 PLA-α-細辛腦熒光納米粒制備

參照2.1項下方法，在PLA-α-細辛腦熒光納米粒制備過程中除有機相中加入0.1%的香豆素-6，其他步驟同2.1。

2.3 給藥方式與劑量

2.3.1 PLA-α-細辛腦熒光納米粒血藥動力學研究 12只SD大鼠隨機分成2組，每組6只，分別進行PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥及尾靜脈注射。實驗前禁食（不禁水）12 h。鼻腔給藥方式如下：大鼠乙醚吸入麻醉后仰臥姿勢放置，給藥前將40 μL質量濃度為10 g·L^-1PLA-α-細辛腦納米粒混懸液吸入微量進樣針，微量進樣針前端套上塑料皮管對鼻腔進行保護，將微量進樣針前端插入大鼠鼻腔，深度不超過8 mm，2個鼻孔分別給藥20 μL，整個給藥過程在麻醉后1 min內完成。靜脈給藥方式如下：大鼠乙醚吸入麻醉后裝入靜脈注射籠，靜脈注射器吸入約0.8 mL質量濃度為50 mg·L^-1的PLA-α-細辛腦納米粒進行尾靜脈注射，所有大鼠平均給藥劑量約為1.6 mg·kg^-1（該劑量是根據α-細辛腦納米粒混懸液最大濃度以及大鼠鼻腔液體給藥量而定），該給藥劑量也與文獻[10]基本一致。

2.3.2 PLA-α-細辛腦熒光納米粒腦藥動力學研究 48只SD大鼠隨機分成2組，每組24只。給藥方式與劑量同2.3.1，進行PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射與鼻腔給藥后腦藥動力學研究。

2.3.3 PLA-α-細辛腦熒光納米粒的藥代動力學研究 24只SD大鼠隨機分成2組，每組12只。給藥方式同2.3.1，根據香豆素-6在納米粒中的含量，將熒光納米粒配制成適當的濃度供大鼠鼻腔給藥和尾靜脈注射（香豆素-6的含量為10 μg）。

2.4 樣品采集與處理

2.4.1 血藥動力學研究樣品采集與處理 鼻腔給藥和尾靜脈注射后分別于給藥后1，3，5，10，15，30，45，60，90，120，180，240 min眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，3 500 r·min^-1離心15 min，分離血漿，于-70 ℃冰箱冷凍保存待測。檢測前，取出血漿至室溫解凍后，精密吸取150 μL于干凈離心管中，加入20 μL質量濃度為1 mg·L^-1吲哚美辛[11]內標液后，再加入1 000 μL水飽和正丁醇，微型混合器渦旋3 min進行萃取，14 000 r·min^-1離心10 min，取800 μL上清液至另一干凈的離心管中，在40 ℃的水浴中用氮氣濃縮儀吹干，殘渣加入100 μL復溶液（0.1%甲酸水-甲醇6∶4），渦旋2 min后，14 000 r·min^-1離心10 min，取上清液進樣5 μL分析。

2.4.2 腦藥動力學研究樣品采集與處理 給藥后每組分別于5，15，30，45，90，180 min處死4只大鼠，從頭蓋骨下取出全腦組織，所有樣品于-70 ℃冷凍保存待測。檢測前，取出樣品，精密稱取混勻后的腦組織0.3 g于0.5 mL離心管，加入900 μL蒸餾水，勻漿機勻漿后取勻漿液150 μL，加入20 μL質量濃度為1 mg·L^-1吲哚美辛內標液，渦旋混勻后，加入1 000 μL水飽和正丁醇，渦旋震蕩5 min，14 000 r·min^-1離心10 min，吸取800 μL上清液氮氣吹干。殘渣加入100 μL復溶液（0.1%甲酸水-甲醇=6∶4），渦旋震蕩5 min，14 000 r·min^-1離心10 min后，取上清進樣5 μL分析。

2.4.3 熒光標記法樣品采集 給藥后每組分別于5，30，90，180 min處死3只大鼠，取下心、肝、脾、肺、腎及腦組織，所有樣品于-70 ℃冷凍保存待測。

2.5 檢測方法

2.5.1 色譜條件及質譜條件 ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），0.5～1.0 min，90%A；1.0～2.0 min，90%～65%A；2.0～4.8 min，65%～35%A；4.8～5.0 min，35%～10%A；5.0～5.5 min，10%～90%A；5.5～6.0 min，90%A；流速0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。質譜條件為：α-細辛腦母離子相對分子質量209.0，子離子相對分子質量181.0，錐電壓34 V，碰撞能量16 V，保留時間4.0 min，離子模式ES⁺；吲哚美辛母離子相對分子質量360.0，子離子相對分子質量140.9，錐電壓48 V，碰撞能量20 V，保留時間4.6 min，離子模式ES⁺。

2.5.2 熒光標記物的檢測方法 取出-70 ℃冷凍保存的大鼠組織樣品心、肝、脾、肺、腎及腦，將每只動物的組織樣品放入小動物活體熒光成像儀中，對其進行熒光成像，以504 nm作為發射波長，確定示蹤納米粒在大鼠體內不同組織的分布情況。

2.6 數據分析

2.6.1 血藥濃度數據處理 采用藥動學計算程序DAS 2.2.1，計算α-細辛腦的藥動學參數。實驗數據以±s表示。鼻腔給藥的絕對生物利用度見下。

2.6.2 腦組織濃度數據處理 采用藥動學計算程序DAS 2.2.1，計算α-細辛腦的藥動學參數。藥物靶向指數[12]（DTI），藥物靶向效率[13]（DTE），鼻腦直接傳遞百分比[14]（DTP）計算公式見下。其中，Bi.n.為藥物經鼻腔給藥后的AUCbrain，Bx為藥物經鼻腔給藥后通過血液循環透過血腦屏障進入腦部的AUCbrain，Bi.v.為藥物靜脈注射后的AUCbrain，Pi.v.為藥物靜脈注射后的AUCplasma，Pi.n.為藥物鼻腔給藥后的AUCplasma，實驗數據以±s表示。

3 結果

3.1 血藥動力學研究

α-細辛腦在血漿中的含量測定方法學考察結果顯示：該液質檢測條件下，空白血漿中的內源性物質不干擾樣品峰，α-細辛腦及吲哚美辛的峰分離良好，相互間無干擾，方法專屬性好。其中，α-細辛腦與內標物吲哚美辛的保留時間分別為4.0，4.6 min，見圖1。線性方程Y=0.029C-0.021 9，r=0.999 3（4.955～991 μg·L^-1）。定量限和檢測限分別為2.5，0.5 μg·L^-1。日內相對標準偏差、日間相對標準偏差、溶液穩定性、回收率及基質效應考察均符合要求。

PLA-α-細辛腦納米粒經鼻腔、靜脈注射給藥后，α-細辛腦在大鼠體內的藥代動力學曲線見圖2。2種給藥方式均在第一時間達到了最大血藥濃度，且鼻腔給藥的血藥濃度均小于靜脈注射。PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥與靜脈注射的Cmax分別為（216.2±45.2），（433.2±158.3） μg·L^-1。

PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射的AUC0-t與AUC0-∞均大于鼻腔給藥，且具有顯著性差異。PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射后與鼻腔給藥后的MRT0-t無顯著性差異。PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后的絕對生物利用度為74.2%，低于α-細辛腦干粉鼻腔給藥的絕對生物利用度[15]，見表2。

3.2 腦藥動力學研究

α-細辛腦在腦組織中的含量測定方法學考察結果顯示：該液質檢測條件下，空白腦組織中的內源性物質不干擾樣品峰，α-細辛腦及吲哚美辛的峰分離良好，相互間無干擾，方法專屬性好，α-細辛腦與吲哚美辛的保留時間分別為4.0，4.6 min，見圖3。線性方程Y=0.027 6C+0.340 9，r=0.997 4（4.955～991 ng·g^-1）。定量限和檢測限分別為2.5，0.5 ng·g^-1。日內相對標準偏差、日間相對標準偏差、穩定性、回收率及基質效應考察均符合要求。

PLA-α-細辛腦納米粒經鼻腔給藥、靜脈注射后α-細辛腦在5，15，30，60，90，180 min在腦組織中的分布見圖4，PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后α-細辛腦在腦組織中的濃度大于靜脈注射后α-細辛腦在腦組織中的濃度，PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后α-細辛腦在腦組織中的Cmax與靜脈注射后的α-細辛腦在腦組織中的Cmax分別為（219.3±48.8），（166.3±21.2） ng·g^-1。PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射后α-細辛腦在腦組織中的AUC0-t與AUC0-∞均小于鼻腔給藥，但無顯著性差異。此外，PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射后與鼻腔給藥后α-細辛腦在腦組織中的MRT0-t均無顯著性差異，見表3。

PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射與鼻腔給藥后藥物的腦靶向系數（AUCbrain/AUCplasma）分別為1.16和1.65，PLA-α-細辛腦納米粒經鼻給藥后的藥物腦靶向效率（DTE）為142.24%，鼻-腦傳遞百分率（DTP）為29.83%。

3.3 熒光標記法研究

香豆素-6是一種脂溶性熒光染料，其檢測靈敏度較高，常用于納米粒遞藥系統的體內外示蹤和相關機制的研究[16-18]。根據文獻報道，香豆素-6作為熒光探針不會影響載體本身的各項特性，可以較好的反應納米粒的行為，且香豆素-6泄漏程度較低，一般情況下小于5%[19-21]。

PLA-α-細辛腦熒光納米粒靜脈注射后5 min時，其在肝組織中的熒光強度最大，其次為腦組織，而心、脾、肺、腎幾乎無熒光。30 min時，與5 min相比，肝、腦組織中的熒光強度減弱，心、脾、肺、腎出現少量熒光，但肝組織中的熒光強度與其他組織相比，仍是最強的，90 min時，心、脾、肺中的熒光面積相對增大，強度仍較弱，180 min時，熒光強度在所有組織中都降低。PLA-α-細辛腦熒光納米粒鼻腔給藥后5 min時，其在腦組織中的熒光強度最大，其次為肝組織。與5 min相比，30 min時腦、肝組織中的熒光強度減弱，心、肺、腎熒光強度增加，但脾中幾乎無熒光。90 min時，腦組織中的熒光強度與其他組織相比，仍是最強的，與30 min時相比，心和腎中的熒光面積相對減小，180 min時，組織中的熒光強度在4個時間點中最低，見圖5，6。

此外，在5 min和30 min時，PLA-α-細辛腦熒光納米粒靜脈注射后香豆素-6在肝組織中的熒光強度明顯強于PLA-α-細辛腦熒光納米粒鼻腔給藥后香豆素-6在肝組織中的熒光強度；而PLA-α-細辛腦熒光納米粒靜脈注射后香豆素-6在腦組織中的熒光強度明顯弱于PLA-α-細辛腦熒光納米粒鼻腔給藥后香豆素-6在腦組織中的熒光強度。從某種程度上可以認為：納米粒靜脈注射后具有較強的肝靶向性，而鼻腔給藥后腦靶向性更強。

4 討論

本文采用與靜脈注射對比的給藥方式，研究了PLA-α-細辛腦納米粒經鼻給藥后α-細辛腦在體內的分布及腦靶向性，結果表明：PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后的腦靶向性強于PLA-α-細辛腦納米粒靜脈注射后的腦靶向性。腦靶向系數分別為1.65，1.16。PLA-α-細辛腦納米粒鼻腔給藥后的絕對生物利用度為74.2%，與文獻[22]相一致，表明不同的給藥途徑能改變藥物的腦靶向性。PLA-α-細辛腦納米粒經鼻腔給藥后進入腦組織主要存在2種通路，即一部分藥物通過呼吸部黏膜吸收進入血液循環后，透過血腦屏障而進入腦組織，另一部分藥物通過嗅黏膜或嗅神經通路直接進入腦組織，后者避開了血腦屏障，這與文獻[23-24]報道相一致。張龍開等[25]將β-細辛醚制備成微乳進行鼻腔給藥用于治療阿爾茨海默病，結果發現鼻腔給予含藥微乳系統后腦靶向性良好，β-細辛醚微乳鼻腔給藥后得到的AUCbrain/AUCplasma均高于靜脈注射給藥，這與本文的結果也相一致。藥物經鼻腔給藥后達藥峰濃度的時間較短，可以起到速效的作用[26]。此外，目前還有將α-細辛腦制備成鼻用mPEG-PLA微粒[27]及納米粒離子敏感型鼻用原位凝膠[28]的研究。

本課題組在之前的研究中采用氣流粉碎的方式，將α-細辛腦粉末制備成α-細辛腦鼻用干粉吸入劑，通過鼻腔給藥的方式可以較好的將藥物導入腦部，但是由于該干粉的粒徑范圍較寬，有部分干粉通過吸入到達了肺部，且藥物濃度與靜脈注射到達肺部的量相當[15]。本文的研究結果可以發現：PLA-α-細辛腦納米粒經鼻腔給藥后，香豆素-6在肺組織中的熒光強度遠遠低于靜脈注射后的熒光強度，解決了α-細辛腦鼻用干粉吸入劑到達肺部量較多的缺點。但是，哪些因素影響PLA-α-細辛腦納米粒經過不同的通路到達腦組織還需進一步研究。

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[責任編輯 曹陽陽]