prd29A—otsAB表達載體的構建與轉化本生煙草的研究

吳洪敏　朱秀左　馬龍雪

摘要：分別以擬南芥（Arabidopsis thaliana）和大腸桿菌（Escherichia coli）的基因組DNA為模板，通過PCR技術克隆得到rd29A啟動子、otsA和otsB基因，將其依次插入到p2300-gfp質粒中，從而構建p2300-prd29A-otsAB融合基因表達載體。利用農桿菌介導法將prd29A-otsAB融合基因導入到本生煙草（Nicotiana benthamiana）中，通過對轉基因煙草進行篩選，初步獲得具有卡那霉素抗性的轉基因植株，為今后進一步研究相關基因的功能以及通過基因工程技術提高植物的抗脅迫能力奠定基礎。

關鍵詞：海藻糖；prd29A；otsA基因；otsB基因；本生煙草（Nicotiana benthamiana）；農桿菌

中圖分類號：Q943.2；S572 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2148-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.039

Abstract： The rd29A promoter of Arabidopsis thaliana，otsA and otsB genes in Escherichia coli were cloned by PCR respectively. Afterwards，the target fragments were ligated into plasmid p2300-gfp，which would lead to the construction of p2300-prd29A-otsAB expression vector. By Agrobacterium-mediated method，the prd29A-otsAB fusion gene was introduced into Nicotiana benthamiana，and then the transgenic Nicotiana benthamiana was obtained through the tissue culture and antibiotics screening for the first time. The experimental results can provide the reference for improving the stress resistance of plants through genetic engineering.

Key words： trehalose；rd29A promoter；otsA gene；otsB gene；Nicotiana benthamiana；Agrobacterium

土壤鹽堿化是制約農作物生長及產量提高的重要因素，土壤中鹽分過高，會引起植物出現滲透脅迫、離子毒害、營養元素虧缺等癥狀，正常的生長發育受阻[1]。植物可通過在細胞中積累某些滲透保護劑維持對水分的吸收，消除鹽脅迫所造成的傷害[2]。海藻糖為其中一類重要的滲透保護劑，由2個葡萄糖分子縮合而成[3]。目前發現至少有5種不同的海藻糖合成途徑，其中最為典型的是TPS/TPP途徑[4，5]。在該途徑中，6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后在6-磷酸海藻糖磷酸化酶（TPP）的作用下發生去磷酸化生成海藻糖[6]。已有研究表明，轉入海藻糖合成相關基因，可以改善植物對逆境的抵御能力。將酵母TPS基因導入馬鈴薯、玉米和水稻中，植物抵御干旱和鹽脅迫的能力明顯提高[7-9]。大腸桿菌otsA和otsB基因分別編碼TPS和TPP，otsAB融合基因的表達極大地提高了水稻對非生物脅迫的耐受能力[10]。過量表達AtTPS1基因，擬南芥耐旱性也得到了提高[11]。OsTPS1過表達顯著增強了水稻抗低溫、高鹽和干旱等逆境脅迫的能力[12]。海藻糖與植物的抗逆性密切相關，但其在植物體內含量極低[10]。因此，如何有效地提高植物體內海藻糖的含量，進而增強植物的抗逆能力，已成為當前研究的重要課題之一。

本生煙草（Nicotiana benthamiana）為重要的模式植物，但有關海藻糖在其體內合成方面的研究鮮見報道。本試驗通過根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導的葉盤法將prd29A-otsAB表達載體導入到本生煙草中，以期有效提高轉基因植株中海藻糖的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本生煙草和擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子，由山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心提供。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101由濱州學院生命科學系基因工程實驗室保存，p2300-gfp質粒由蘭州大學細胞研究所提供。

1.1.2 試劑 限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、高保真PCR擴增試劑盒為TaKaRa公司產品，DNA Marker 3、pTZ57R/T載體為蘭州鵬程生物技術有限公司產品，Taq酶、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為Fermentas公司產品。

1.1.3 培養基 共培養培養基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。篩選培養基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+Carb（Carbenicillin）+Kan （Kanamycin）。增殖培養基：MS+Carb+Kan。生根培養基：MS+0.1 mg/L NAA+Carb+Kan[2]。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據GenBank數據庫中擬南芥rd29A啟動子（prd29A）、大腸桿菌otsA和otsB基因序列的相關信息進行引物設計。引物序列（下劃線代表酶切位點的位置）如下：prd29A-F（5′CGCAAGCTTAGATTTGGGGTTTTGCTTTTGAATG3′）（HindⅢ）、prd29A-R（5′GCGGAGCTCTTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAA3′）（SacⅠ）、otsA-F（5′GAG CTCTAGAATGAGTCGTTTAGTCGTAGT3′） （XbaⅠ）、otsA-R（5′ATAGTCGACCGCAAGCTTTGGAAAGGTAG3′）（SalⅠ）、otsB-F（5′ATAGAGCTCATGACAGAACCGTTAACCGAAACC3′）（SacⅠ），otsB-R（5′GCGTCTAGAGATACTACGACTAAACGACTCATAGT 3′）（XbaⅠ）。分別以擬南芥和大腸桿菌基因組DNA為模板，高保真PCR擴增相應的目的片段。

1.2.2 植物表達載體的構建 將prd29A、otsA和otsB分別插入pTZ57R/T，構建pTZ57R/T-prd29A、pTZ57R/T-otsA和pTZ57R/T-otsB克隆載體。用限制性核酸內切酶HindⅢ-SacⅠ酶切質粒p2300-gfp和pTZ57R/T-prd29A，連接回收目的片段，構建p2300-prd29A-gfp表達載體。用SacⅠ-XbaⅠ酶切連接pTZ57R/T-otsB和p2300-prd29A-gfp，構建p2300-prd29A-otsB表達載體。用XbaⅠ-SalⅠ酶切pTZ57R/T-otsA和p2300-prd29A-otsB，實現p2300-prd29A-otsAB融合基因表達載體的構建（圖1）。

1.2.3 抗生素敏感性試驗 將本生煙草葉片分別接種到含0、10、20、30、40、50、60和100 mg/L卡那霉素的不定芽誘導培養基中，30 d后根據外植體的分化情況，確定轉基因植株合適的篩選濃度。在農桿菌生長培養基和本生煙草不定芽誘導培養基中分別添加羧芐青霉素（Carb），將Carb的濃度設為0、100、200、300、400、500、600和1 000 mg/L共8個水平，分別接種含p2300-prd29A-otsAB重組質粒的農桿菌和本生煙草葉片，觀察農桿菌和外植體的生長狀態和存活情況，確定轉基因植株篩選過程中去除農桿菌合適的Carb濃度。

1.2.4 本生煙草的遺傳轉化 將含重組質粒的農桿菌進行振蕩培養，測其OD600 nm約為0.5時進行離心，加入等量的MS基本培養基懸浮菌體；以本生煙草的葉片作為外植體，置于菌液中侵染3～5 min；吸干后接種到共培養培養基，2 d后將葉片轉入篩選培養基中誘導抗性芽，并在增殖培養基中對抗性芽進行增殖培養；切取合適大小的不定芽，在生根培養基中誘導抗性芽生根。

2 結果與分析

2.1 p2300-prd29A-otsAB融合基因表達載體的構建

分別以野生型擬南芥和大腸桿菌基因組DNA為模板，高保真PCR擴增擬南芥prd29A、大腸桿菌otsA和otsB（圖2A）。回收PCR擴增產物，連入pTZ57R/T載體。分別酶切p2300-gfp和pTZ57R/T-prd29A，連接后轉入大腸桿菌。通過PCR和酶切技術對重組質粒進行鑒定，結果顯示prd29A已連入p2300-gfp，從而實現p2300-prd29A-gfp表達載體的構建（圖2B）。分別酶切pTZ57R/T-otsB和p2300-prd29A-gfp，將回收的目的片段進行連接，鑒定重組體，表明otsB基因已插入p2300-prd29A-gfp，從而實現p2300-prd29A-otsB表達載體的構建（圖2C）。分別酶切pTZ57R/T-otsA和p2300-prd29A-otsB，回收、連接目的片段，鑒定結果表明otsA基因已插入p2300-prd29A-otsB，從而實現p2300-prd29A-otsAB融合基因表達載體的構建（圖2D）。

2.2 抗生素對本生煙草不定芽誘導和農桿菌生長的影響

將本生煙草葉片接種到含不同濃度Kan的不定芽誘導培養基中。30 d后在不含Kan的對照培養基上，外植體產生大量的不定芽（圖3A）；而添加Kan的培養基中，多數葉片變黃，難以分化（圖3B-H）。當Kan濃度為10～20 mg/L時，少數葉片產生少量綠色的芽點；當Kan濃度為30～40 mg/L時，僅有極少量細胞存活，絕大多數葉片已完全枯萎；當Kan濃度大于50 mg/L時，葉片完全白化死亡。因此，50 mg/L可作為臨界濃度篩選轉化細胞。Carb能有效抑制農桿菌的生長，當農桿菌p2300-prd29A-otsAB接種于Carb濃度大于100 mg/L的培養基時，農桿菌的生長幾乎完全受到抑制，而對照則可正常生長（圖3I、J），表明農桿菌p2300-prd29A-otsAB對Carb極其敏感，極少量的Carb也能有效抑制根癌農桿菌的生長。用不同濃度的Carb處理本生煙草的葉片，當Carb濃度100～500 mg/L時，外植體不定芽誘導效果明顯優于對照（圖3K-P）；當Carb濃度達到600 mg/L時，抗性芽的分化受到抑制（圖3Q）；而當Carb濃度為1 000 mg/L時，外植體嚴重白化，抗性芽的分化率明顯降低（圖3R）。因此，Carb抑制農桿菌生長的最佳使用濃度為500 mg/L。

2.3 prd29A-otsAB融合基因轉化本生煙草

活化含prd29A-otsAB融合基因的農桿菌，葉盤法轉化本生煙草。將共培養2 d的外植體接種到含50 mg/L Kan和500 mg/L Carb的篩選培養基中進行抗性誘導。15 d后葉片上產生大量綠色的芽點，其中部分芽點已形成不定芽（圖4A）。21 d后多數芽點已生長為成簇分布的抗性芽（圖4B）。隨著培養時間的延長，抗性芽不斷分化，生長旺盛（圖4C-F）。將培養30 d的葉片轉移至含50 mg/L Kan和250 mg/L Carb增殖培養基中繼續培養14 d，可獲得大量生長狀態良好的不定芽（圖4G、H）。切取不定芽，接種于添加50 mg/L Kan和250 mg/L Carb生根培養基中誘導生根（圖4I）。約30 d后，不定芽開始生根成苗。8周后抗性芽基部產生大量的根，試管苗生長健壯（圖4J、K）。當根布滿瓶底，幼苗高度約8～10 cm時，便可進行抗性苗的馴化移栽（圖4L）。

3 小結與討論

為了有效提高植物體內海藻糖的含量，本試驗成功克隆了擬南芥rd29A啟動子、大腸桿菌otsA和otsB基因并構建了prd29A-otsAB融合基因表達載體。利用根癌農桿菌介導的葉盤法將其導入到受體細胞中。海藻糖是非還原性雙糖，廣泛存在于生物體內，它不僅能為生物體的新陳代謝提供和儲存能量，而且在非生物脅迫條件下，海藻糖可以保護生物體組織和大分子的功能和活性[6]。植物在遭受逆境脅迫時，海藻糖含量提高，進而增強植物對不良環境的耐受性[13]。海藻糖提高植物抗逆性的分子機制尚不清楚。已有研究表明，在植物體內，TPS和TPP催化海藻糖的生物合成[5，6]。海藻糖合成相關基因在植物生長發育、逆境調控中具有重要作用，通過轉入海藻糖合成相關基因可以改善植物對逆境的抵御能力。將酵母TPS1基因導入玉米中，可以促進玉米根系生長，提高脯氨酸與葉綠素含量，增強玉米的抗旱能力[8，9]。壇紫菜PhTPS基因在中高水平失水條件下，其表達水平可顯著上調[14]。轉大腸桿菌otsA基因的本生煙草幼苗在含有150 mmol/L NaCl的培養基中生長效果明顯優于對照[15]。

與傳統的抗逆育種工作相比，基因工程育種以其特有的優勢，受到越來越多的關注。現階段，海藻糖合成相關基因不斷被克隆并導入相應的受體細胞中，但海藻糖的合成效果仍不理想，植物的抗逆效果有待于進一步提高。外源基因在受體植物中的表達受多種因素的影響，其中啟動子在決定基因表達方面起重要作用。rd29A啟動子屬于逆境誘導型啟動子，植物只有在受到干旱、高鹽、低溫等脅迫時，該啟動子才驅動目的基因表達[16]。

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