柴胡分子生藥學研究進展

韓曉偉 嚴玉平 吳蘭芳 楊加虎 鄭玉光

摘要：分子生藥學是一門新興的以生藥為研究對象的交叉學科，其發展為傳統的生藥學研究提供了新的理論方法和技術，使對生藥的研究達到了基因水平。柴胡作為傳統中藥，在傳統研究方法基礎上，也開展了分子生藥學研究，并取得了一定成果。本文綜述了近年來采用分子生藥學手段的柴胡相關研究，并對該領域進行了展望，以期為進一步推動柴胡資源及其他中藥資源的保護、開發和利用提供參考。

關鍵詞：分子生藥學；基因；柴胡；分子生物技術；中藥資源

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.032

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0125-04

Abstract： Molecular pharmacognosy is an emerging interdisciplinary subject with crude drugs as research subjects. Its development provides a new theoretical method and technique for traditional pharmacognosy research， so that the study of crude drugs has reached the level of gene. As traditional Chinese materia medica， Bupleuri Radix has developed molecular pharmacognosy research on the basis of traditional research methods， and achieved certain results. This article summarized the research achievements of Bupleuri Radix through molecular pharmacognosy method in recent years， and prospected this field， in order to further provide references for the protection， development and utilization of Bupleuri Radix resources and other TCM resources.

Key words： molecular pharmacognosy； gene； Bupleuri Radix； molecular biological technology； TCM resources

分子生藥學是生藥學和分子生物學相互融合形成的一門新興的交叉學科，由黃璐琦院士在1995年首次提出[1]。分子生藥學的提出，使生藥學研究有了新的理論方法和技術，使我國生藥學研究又邁上了一個新的臺階。經過20多年的發展，分子生藥學在中藥分子標識鑒定、中藥資源保護和利用、中藥優質高產方面都取得了很好的成果，使生藥學研究不再停留于藥用植物組織器官的層面，而是擴展到基因的層面，為后基因組時代研究中草藥奠定了基礎[2]。

柴胡是我國常用的大宗中藥材之一，歷代本草典籍對其藥性都有明確記載。柴胡性味苦寒，入肝膽經，具和解表里、疏肝、升陽之功效，主要用于感冒發熱，寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等病證的治療。2015年版《中華人民共和國藥典》[3]中規定的正品柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡B. scorzonerifolium Willd.的干燥根，前者習稱“北柴胡”，后者習稱“南柴胡”。在分子生藥學發展的20多年里，關于柴胡的分子生藥學方面的研究也在持續進行。本文對近年柴胡分子生藥學方面的研究進行了總結，以期為在分子水平對柴胡進行更深層次的研究提供參考。

1 柴胡生藥鑒定的分子標記研究

生藥鑒定是生藥學的重要組成部分，生藥鑒定的主要任務是研究生藥的來源、品種鑒定、質量評價等。我國生藥的品種繁多、來源復雜，在一定程度上制約了中藥的安全應用。柴胡作為我國常用的大宗中藥材，具有來源復雜、品種豐富等特點[4]，而利用傳統的理化鑒別和性狀鑒別的方法不能準確鑒別柴胡藥材的來源和種屬，因此，利用分子標記技術研究柴胡的種屬鑒別逐漸成為研究熱點。

分子標記技術以1974年Grozdicker首創RFLP（限制性片段長度多態性）為開端，到2003年Paul Hebert提出DNA條形碼技術，短短30年的時間里各國的科學家提出了十幾種分子標記技術，其中常用的有RFLP、RAPD（隨機擴增多態性DNA）、SSR（簡單重復序列）、AFLP（擴增片段長度多態性）、ISSR（簡單重復序列區間）和DNA barcoding（DNA條形碼）等。

1.1 RAPD技術

RAPD是第二代分子標記技術，該技術在植物中的應用比較廣泛，但其不足之處是穩定性相對較差，不同的物種需要使用不同的反應條件，即使同一物種的同一引物在實驗條件改變時產生的譜帶也會發生改變。AFLP技術與RAPD技術相似，其特點也是可以簡單快速的鑒定植物，但其穩定性也不佳。2002年，梁之桃等[5]對柴胡屬的物種植物進行了RAPD分析和分類鑒別，這是對柴胡進行RAPD研究的開始。2003年，王秀全等[6]對柴胡種源的道地性進行了RAPD分析，發現利用RAPD可以準確的鑒定柴胡的道地性。隨著對柴胡研究的深入，全國柴胡的主產區都開展了柴胡品種的RAPD鑒定[7-10]，同時，對RAPD的技術進行了一些優化[11]，使其更適合柴胡的分析。在資源鑒定的基礎上，對柴胡的干根藥材、愈傷組織、試管植株等進行了RAPD分析[12-14]。

1.2 SSR和ISSR技術

SSR又稱為微衛星DNA或短串聯重復，ISSR是在SSR的基礎上發展起來的一種分子標記技術。SSR和ISSR可揭示更高的多態性，而且快速、簡便，因此在中藥材鑒定中得到了廣泛應用。2008年，隋春等[15]首次以北柴胡為材料進行了ISSR分析，這為利用ISSR技術鑒定柴胡種質資源、分子標記輔助育種以及遺傳多樣性研究奠定了基礎。2010年，戰晴晴等[16]利用SSR和ISSR技術構建了北柴胡的遺傳圖譜，使對柴胡的研究進一步深入。2013年，楊旻等[17]利用綜合評分法對柴胡的ISSR-PCR反應體系進行了優化。2015年，馬艷芝等[18]對不同柴胡種質資源的ISSR和ITS進行了序列分析，認為將ISSR和ITS（轉錄間隔區）技術相結合可提高柴胡種質資源鑒定的準確性。隨著SSR和ISSR技術的不斷完善，利用該技術鑒定柴胡的研究不斷深入。趙香妍等[19]對北京地區野生的柴胡種質資源進行了ISSR研究，確定了百花山山腰及山腳的柴胡適宜推廣種植，為柴胡栽培品種的選育提供了新選擇。吳素瑞等[20]對柴胡的栽培品種進行了SSR的分子標記鑒別。通過長期反復的實驗摸索，采用SSR和ISSR技術成為鑒別柴胡種質資源的有效方法。

1.3 DNA條形碼

DNA條形碼的鑒定是分子鑒定的最新發展方向，它是通過比較物種中的一段標準的DNA片段，對物種進行快速、準確的識別和鑒定[21]。適于植物的條形碼包括psbA-TrnH、rbcL、rpoC1、rpoB、matK、ITS、ITS2等。2004年，Neves S S等[22]首次基于柴胡屬植物的ITS序列對其進行了聚類分析。2005年，武瑩等[23]對5種習用柴胡進行了ITS的序列鑒別。2006年，謝暉等[24]對9種柴胡屬植物的核糖體ITS序列進行了擴增和應用。近5年來，柴胡的鑒定主要以ITS和ITS2擴增為主要方法[25-29]，這為柴胡種質資源鑒定以及藥材市場柴胡的真偽鑒別提供了快速簡便的方法。

在ITS擴增的研究基礎上，劉力等[30]進行了DNA芯片研究，涉及18種柴胡DNA芯片，發現基于18種柴胡的ITS序列的差別所設計的DNA芯片可以將其區分開，這為柴胡的鑒定提供了新的方法。

2 柴胡有效成分生物合成分子機理與調控研究

傳統中藥材的有效成分絕大多數為次生代謝產物，合成路徑復雜，其反應過程往往需要十幾個甚至幾十個酶的催化，因此，找到形成特定產物的關鍵酶就成為對藥材進行合成的分子機理與調控研究的關鍵步驟，從而進一步利用基因工程技術生產藥用植物的有效成分。柴胡皂苷的結構均為五環三萜類齊墩果烷型衍生物，20世紀90年代，人們對萜類的生物合成途徑進行了研究，根據Ruzika原則提出了萜類生物合成的中心途徑。在此基礎上，董樂萌等[31]開始對合成皂苷途徑的關鍵酶的基因片段進行了克隆和序列分析，為進一步克隆全序列及了解調控柴胡皂苷的生物合成奠定了基礎。2010-2015年，北柴胡鯊烯合酶基因[32]、IPPI基因[33]、UGT基因[34]、北柴胡細胞色素P450基因[35]、北柴胡糖基轉移酶基因BcUGT1[36]、BcUGT3和BcUGT6[37]、BcUGT8[38]、與P450相關基因cyp716y1[39]等與北柴胡皂苷合成相關基因相繼被克隆和分析，同時還進行了一些遺傳轉化方面的初步研究[40]。此類研究為揭示柴胡皂苷合成途徑的分子機理奠定了基礎。

中藥材是非模式植物，因此進行基因克隆一般按照與其相似的植物序列來設計通用引物，序列擴增后還要進行比對，從而確定是否為該藥用植物的正確序列。這種研究基因的方法工作量很大，且無法反映基因表達的全貌。轉錄組研究較好克服了上述缺點，具有時間性和空間性，它反映的是特定條件下活躍表達的基因。通過轉錄組的分析，可高通量地獲得基因表達的RNA水平相關信息，而且可揭示基因表達和生命現象之間的聯系，從而揭示生命體的生理活動規律，確定其代謝特性[2]。2011年，Sui C等[41]利用新一代的高通量測序技術454 GS-FLX Titanium對北柴胡進行了轉錄組研究，揭示了柴胡皂苷合成的分子途徑，為后續的皂苷關鍵酶基因克隆及功能分析奠定了基礎。2015年，該課題組對“南柴胡”和“北柴胡”進行了轉錄組分析，揭示了二者之間皂苷合成途徑的差異，為從分子水平揭示道地藥材形成的原因提供了較好范本[42]。

3 脅迫條件下柴胡皂苷合成的分子機制研究

許多植物的藥效成分都是該植物的次生代謝產物，植物次生代謝產物是植物對環境的一種適應，同時也是植物的主要防御機制之一，植物的防御反應可誘導多種萜類的次生代謝產物的產生和積累[43]。2016年，張宇等[44]研究了干旱脅迫下北柴胡中柴胡皂苷合成途徑關鍵酶基因表達量的變化，發現適度的干旱脅迫能夠提高柴胡皂苷合成途徑關鍵酶基因表達量，同時發現基因表達量與皂苷含量呈正相關，從而為揭示脅迫下藥用植物藥效成分積累的分子機制奠定了基礎。

隨著柴胡轉錄組研究和功能基因的克隆與分析的深入，柴胡響應脅迫的分子機制的研究必將取得較大發展。

4 柴胡細胞、組織和轉基因器官培養與活性成分生產

運用分子生物學的方法來研究中藥材的最終目的是最大限度地獲得中藥材的藥效成分，從而彌補中藥材資源不足的情況。利用細胞培養以及轉基因技術可以快速、安全地獲得中藥材的藥效成分，是中藥材研究和開發的新方向。柴胡的細胞培養研究尚處在初級水平。1995年，郝建平等[45]進行了柴胡細胞的固定化培養，但之后的十幾年此類研究發展不大。2008年，吳曉玲等[46]進行了銀柴胡細胞培養的嘗試。2012年，徐爽等[47]研究了三島柴胡懸浮細胞的培養并對培養條件進行了優化。2016年，程玉鵬等[48]對狹葉柴胡的愈傷和懸浮細胞成分進行了分析。上述研究為大規模進行柴胡的細胞培養進行了有益的探索。

5 展望

柴胡的分子生藥學研究只是我國中藥材研究的一部分，而利用分子生藥學技術對柴胡的研究尚處于起步階段，前景廣闊。利用分子生藥學可以辨別柴胡的真偽，闡述皂苷合成的分子機理，但由于柴胡完整的基因序列尚不明確，大部分柴胡基因相關研究只是一個“近似值”，這也是我國中藥材研究的現狀。

利用分子生藥學的方法研究中藥材實現了我國中藥材研究的突破，使我國中藥材研究邁入新的階段，為中藥材資源保護和利用開創了新的局面。

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（收稿日期：2016-08-08；編輯：向宇雁）