免疫磁珠對紫外線引起CD4細胞γ?H2AX相對熒光強度變化的影響

徐 丹，齊 菲，吳 超，孫野青

（大連海事大學環(huán)境科學與工程學院環(huán)境系統(tǒng)生物學研究所，大連116026）

免疫磁珠對紫外線引起CD4細胞γ?H2AX相對熒光強度變化的影響

徐 丹，齊 菲，吳 超，孫野青?

（大連海事大學環(huán)境科學與工程學院環(huán)境系統(tǒng)生物學研究所，大連116026）

針對免疫磁珠技術中磁珠大小對免疫檢測結(jié)果的影響問題，以三種免疫磁珠為研究對象，分析了單個細胞結(jié)合不同大小磁珠的數(shù)量情況，利用流式細胞術分析了γ?H2AX相對熒光強度變化與輻射劑量的變化關系，探討了免疫磁珠與細胞結(jié)合對紫外線UVC誘發(fā)CD4細胞γ?H2AX相對熒光強度變化的影響。發(fā)現(xiàn)細胞與磁珠比為1∶10時單個細胞至少可以結(jié)合一個磁珠，結(jié)合數(shù)量與磁珠大小有關；UVC輻照引起CD4細胞γ?H2AX相對熒光強度變化與輻射劑量呈線性正相關，小磁珠（50 nm）和中磁珠（2.8μm）與細胞結(jié)合γ?H2AX熒光強度與輻射劑量之間仍具有一定的劑量效應關系，但大磁珠（4.5μm）與細胞結(jié)合會導致γ?H2AX相對熒光強度與輻射劑量的線性關系不明顯。結(jié)果可為今后將免疫磁珠用于輻射誘導的DNA損傷評估奠定基礎。

免疫磁珠；流式細胞術；UVC；γ?H2AX；劑量效應關系

1 引言

免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB，簡稱磁珠）技術是免疫學和磁載體技術結(jié)合而發(fā)展起來的一項技術，其基本原理是：首先免疫磁珠與抗體結(jié)合形成抗體載體；隨后磁珠上抗體與特異性抗原物質(zhì)結(jié)合，形成抗原?抗體?吸住免疫復合物；這種復合物可以在磁力的作用下發(fā)生力學移動，使復合物與其他物質(zhì)分離，達到分離特異性抗原的目的［1］。免疫磁珠由于具有高效、快速、操作簡單、生物相容性好等優(yōu)點，在細胞分選［2］、蛋白提純［3］、病原體檢測［4］等領域都得到了廣泛地應用。然而，磁珠的大小是影響此技術成功的關鍵因素，不同大小的磁珠結(jié)合能力、磁力強弱、分離效果及對目的抗原檢測的影響都不盡相同，因此，在利用免疫磁珠技術進行免疫檢測時有必要探討最適合的磁珠大小，評價結(jié)合效率和特異性。

目前，γ?H2AX被公認為是反映輻射引起DNA損傷的生物標志物［5］。組蛋白H2AX在DNA損傷修復中起重要的作用，H2AX磷酸化形成γ?H2AX，后者聚集多種修復因子在DNA雙鏈斷裂位點，使DNA雙鏈斷裂得以修復［6?8］。近年來，對γ?H2AX的檢測方法主要包括免疫熒光法和流式細胞術。與免疫熒光法檢測γ?H2AX fo?ci［5］相比，利用流式細胞術分析細胞內(nèi)γ?H2AX的表達水平具有檢測操作簡便、快速和高通量等特點，可以排除人為的因素，得到的結(jié)果更加客觀準確，且γ?H2AX相對熒光強度與輻射劑量存在良好的劑量效應關系［9?10］。

人外周血淋巴細胞常用來進行輻射損傷檢測和風險評估［11］，人CD4＋T淋巴細胞簡稱為CD4細胞，是T淋巴細胞的一種，表面有CD4分子，屬于人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞。紫外線輻射是目前誘導DNA損傷最簡便有效的方法［12］，本研究利用紫外線（UVC）進行CD4細胞輻照處理，利用免疫磁珠能與CD4細胞特異性結(jié)合的特性，采用流式細胞術分析比較三種不同大小的磁珠與CD4細胞結(jié)合對紫外線引起γ?H2AX相對熒光強度變化的影響，為今后將免疫磁珠技術用于從外周血分離淋巴細胞進行輻射誘導的DNA損傷評估奠定基礎。

2 材料和方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人CD4＋T淋巴細胞，購自上海復祥生物科技有限公司，懸浮培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，外加10%滅活胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素，置于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每四天按1∶4傳代一次。

2.2 輻照處理

取出CD4＋T淋巴細胞培養(yǎng)瓶，收集培養(yǎng)2天指數(shù)生長期細胞，離心去除細胞上清液，然后加入適量PBS溶液，調(diào)整細胞濃度為2×106／mL－1，吹打混勻后接種到含有1 mL培養(yǎng)液的60 mm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到避光的UVC燈（功率：1100μW／cm2）輻射箱子里，打開培養(yǎng)皿蓋子垂直照射，輻照時間為0、2.5 min、5 min、10 min（對應的輻射劑量為0、16 J／m2、32 J／m2、64 J／m2），輻照后蓋上培養(yǎng)皿蓋子，將培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃恢復培養(yǎng)30 min。

2.3 細胞與磁珠結(jié)合

與CD4＋T淋巴細胞結(jié)合的磁珠有三種：小磁珠（CD4 Microbeads，50 nm）來自Miltenyi Biotec公司，中磁珠（Dynabeads，2.8μm）和大磁珠（Dynabeads，4.5μm）來自Life technologies公司。由于中磁珠和大磁珠在普通顯微鏡下可見，因此進行了細胞與磁珠比例為1∶5和1∶10時單個細胞結(jié)合磁珠數(shù)量的情況分析，隨機選取5個視野中的細胞數(shù)量，不少于100個，統(tǒng)計單個細胞結(jié)合磁珠數(shù)量為1、2、3、4及以上的細胞數(shù)，分析與未結(jié)合磁珠的細胞組相比是否具有統(tǒng)計學意義。

按照操作說明書進行細胞與磁珠的結(jié)合，即取適量能與CD4特異性結(jié)合的磁珠原液，用PBS緩沖液對磁珠進行沖洗，將輻照處理或未處理的細胞制成單細胞懸液，按照細胞與磁珠比例1∶10，將細胞與磁珠在回旋器上（10 rpm）混合孵育15～20 min，充分結(jié)合后進行固定和γ?H2AX的熒光標記染色。

2.4 樣本固定、熒光標記

利用γ?H2AX的熒光標記染色試劑盒（Up?state，Catalog＃17?344）進行固定和染色，具體操作是取出2×106CD4細胞，加入1 mL的1×Fix?ation solution進行重懸；冰上培養(yǎng)20 min固定；用2 mL的1×PBS離心沖洗兩次；用1 mL的1×Permeabilization Solution重懸細胞破膜；取出50μL細胞于新的tube管中，加3.5μL的anti?phospho?Histone H2AX（Ser139）和FITC conjugate（Upstate，Catalog＃16?202），冰上培養(yǎng)20 min，并偶爾輕彈；加100μL的1×Wash Solution對其進行沖洗，重懸在450μL的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式檢測專用管中，用于流式細胞儀檢測。實驗設定3個重復樣品，以單獨加入FITC標記的羊抗鼠IgG（二抗陰性對照）和未加任何抗體的空白管（空白對照）作為對照。

2.5 流式細胞儀檢測

調(diào)整FSC和SSC，選取CD4待測細胞群，以FL1通道獲取FITC信號，收集1×104CD4細胞，獲取幾何平均熒光強度，使用相對熒光強度（實驗組幾何平均熒光強度／二抗陰性對照的幾何平均熒光強度）來反映γ?H2AX表達水平。以輻射劑量為橫坐標，γ?H2AX相對熒光強度為縱坐標，建立劑量?效應曲線，線性相關系數(shù)R2≥0.95認為線性關系極明顯，0.85≤R2＜0.95認為線性關系明顯，R2＜0.85認為線性關系不明顯。

2.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS軟件包（18.0）進行t檢驗分析，p?＜0.05代表有顯著差異，p??＜0.01代表有極顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 UVC輻照引起CD4細胞γ?H2AX熒光強度變化

利用UVC輻照CD4細胞，分析γ?H2AX相對熒光強度與輻照劑量的劑量效應關系，如圖1所示，根據(jù)線性回歸方程計算線性相關系數(shù)R2值為0.922，提示γ?H2AX相對熒光強度與輻照劑量具有明顯的線性正相關。

3.2 小磁珠與細胞結(jié)合對紫外線引起γ?H2AX熒光強度變化的影響

由于小磁珠直徑僅50 nm太小，因此，在普通倒置顯微鏡下無法觀察到細胞與小磁珠的結(jié)合。當小磁珠與CD4細胞結(jié)合時，UVC引起γ?H2AX相對熒光強度的變化與輻照劑量之間仍具有劑量效應關系，如圖2所示，R2值為0.8596，提示γ?H2AX相對熒光強度與輻照劑量呈線性正相關。

3.3 中磁珠與細胞結(jié)合對紫外線引起γ?H2AX熒光強度變化的影響

在普通倒置顯微鏡下可以觀察到細胞與中磁珠的結(jié)合，對細胞與磁珠比例為1∶5和1∶10時分別進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表1，結(jié)果顯示兩種情況下細胞沒有結(jié)合磁珠的百分比只占統(tǒng)計總數(shù)的12%～13%，細胞與磁珠結(jié)合的細胞占統(tǒng)計總數(shù)的77%～78%，但結(jié)合磁珠數(shù)量比例不同。細胞與磁珠比為1∶5時單個細胞結(jié)合1～3個磁珠的所占比例較高，而細胞與磁珠比為1∶10時單個細胞結(jié)合4個以上磁珠比例增加，具有統(tǒng)計學意義。因此，若從磁珠帶動細胞角度上看，中磁珠在細胞與磁珠比為1∶10時在磁場中帶動效果會更好。

當CD4細胞與中磁珠結(jié)合（細胞與磁珠比為1∶10）時，UVC引起γ?H2AX相對熒光強度的變化（見圖3）雖然與單純細胞組相比略降低，但線性相關系數(shù)R2值為0.871，提示γ?H2AX相對熒光強度與輻照劑量具有一定的劑量效應關系，呈線性正相關。

表1 單個細胞結(jié)合中磁珠數(shù)量情況分析Table1 Analysisofthenumberofindividualcellscombinedwithmediumbeads

3.4 大磁珠與細胞結(jié)合對紫外線引起γ?H2AX熒光強度變化的影響

在普通倒置顯微鏡下可以明顯觀察到細胞與大磁珠的結(jié)合，對細胞與磁珠比為1∶5和1∶10時分別進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表2，發(fā)現(xiàn)磁珠比例越少，細胞沒有結(jié)合磁珠的百分比越高，單個細胞結(jié)合大磁珠的數(shù)量以結(jié)合1個磁珠比例最高，分別占42%和38%，具有統(tǒng)計學意義。若從磁珠帶動細胞角度上看，大磁珠帶動的細胞數(shù)太少，不適合在磁場中作為載體帶動細胞。

表2 單個細胞結(jié)合大磁珠數(shù)量情況分析Table2 Analysisofthenumberofindividualcellscombinedwithbigbeads

當CD4細胞與大磁珠結(jié)合（細胞與磁珠比為1∶10）時，UVC輻射在高劑量（64J／m2）下γ?H2AX相對熒光強度（見圖4）與單純細胞組相比降低明顯，導致γ?H2AX相對熒光強度與輻照劑量的線性關系不明顯，R2值僅為0.78。大磁珠與細胞結(jié)合對γ?H2AX相對熒光強度的變化影響較大。

4 結(jié)論

對于三種不同大小的免疫磁珠與細胞的結(jié)合情況，細胞與磁珠比為1∶10時單個細胞至少可以結(jié)合一個磁珠，結(jié)合數(shù)量與磁珠大小有關。中磁珠比大磁珠結(jié)合數(shù)量多，更適合在磁場中帶動細胞，與小磁珠比，中磁珠磁力強，帶動細胞的效果會更好。

對于免疫磁珠與CD4細胞結(jié)合是否會對紫外線引起γ?H2AX熒光強度變化產(chǎn)生影響方面：小磁珠（50nm）和中磁珠（2.8μm）與細胞結(jié)合γ?H2AX熒光強度與輻射劑量之間仍具有一定的劑量效應關系，但大磁珠（4.5μm）與細胞結(jié)合會導致γ?H2AX相對熒光強度與輻射劑量的線性關系不明顯。由此可以看出，大磁珠與細胞結(jié)合對γ?H2AX相對熒光強度的變化影響較大，而中小磁珠的影響不明顯，可以應用于細胞分離后免疫熒光檢測等方面。

目前使用免疫磁珠發(fā)展起來的免疫磁性分離技術，具有簡便、快速、分離純度高等優(yōu)點已被廣泛應用于細胞分離、免疫檢測、基因工程和靶向釋藥等領域。此研究為將來此技術中磁珠的選擇提供的有力的參考價值，并為今后將免疫磁珠技術用于輻射誘導的DNA損傷評估奠定基礎。

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Effects of Immunomagnetic Beads on UVC?induced Changes in Relative Fluorescence Intensity ofγ?H2AX in CD4 Cells

XU Dan，QIFei，WU Chao，SUN Yeqing?
（Institute of Environmental System Biology，College of Environment Science and Engineering，Dalian Maritime University，Dalian 116026，China）

The size of the beads has an impacton the results of the immunoassay in immunomagnetic bead technique.In this study，three kinds of immunomagnetic beads were selected as the research objects.The number of individual cells combined with the beadswas analyzed，the relationship be?tween the relative fluorescence intensity changes ofγ?H2AX and the radiation dose was studied by flow cytometry，and the effects of immunomagnetic beads on UVC?induced relative fluorescence in?tensity changes ofγ?H2AX in CD4 cellswere discussed.Itwas found that the single cell could com?bine at leastone bead when the ratio of cells andmagnetic beadswas1∶10.The number of beads on the cellswas dependent on the size of the beads.UVC?induced changes in the relative fluorescence intensity ofγ?H2AX were linearly correlated with the radiation dose.In the cases of small beads（50 nm）and medium beads（2.8μm），therewas dose?effect relationship between theγ?H2AX fluores?cence intensity and the radiation dose.While for themagnetic beads（4.5μm）combined with the cells，the linear correlation between the relative fluorescence intensity ofγ?H2AX and the radiation dose was not obvious.These resultsmay be helpful for the application of immunomagnetic beads in DNA damage assessment induced by radiation.

immunomagnetic bead；flow cytometry；UVC；γ?H2AX；dose?effect relationship

R811.5

A

1674?5825（2017）01?0114?04

2016?02?26；

2016?12?30

中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（3132014306）；中國科學院空間科學戰(zhàn)略性先導科技專項（XDA04020202?12）

徐丹，女，博士，副教授，研究方向為輻射細胞生物學。Email：jotan1995＠dlmu.edu.cn

?通訊作者：孫野青，女，博士，教授，研究方向為空間輻射生物學。E?mail：yqsun＠dlmu.edu.cn