蛋白C基因多態性及血漿蛋白C水平與慢性高原病易感性的關系研究

羅 偉，崔 森，冀林華，王紅心，李玉麗，馬曉靜，馬 婕

·論著·

蛋白C基因多態性及血漿蛋白C水平與慢性高原病易感性的關系研究

羅 偉*，崔 森，冀林華，王紅心，李玉麗，馬曉靜，馬 婕

目的 探究蛋白C(PC)基因多態性及血漿PC水平與慢性高原病(CMS)易感性的關系。方法 選擇2014年1月—2015年10月移居青海省玉樹藏族自治州玉樹縣青年男性漢族CMS患者30例為CMS組，同期移居而未發生CMS的青年男性漢族健康志愿者30例為對照組。采用PCR直接測序法檢測PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T位點多態性，采用ELISA法檢測血漿PC水平。比較兩組PC基因不同位點多態性及血漿PC水平。結果 CMS組與對照組PC基因-1654C/T位點基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC基因-1654C/T位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。CMS組與對照組PC基因-1641A/G位點基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC基因-1641A/G位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。CMS組與對照組PC基因-1476A/T位點基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC基因-1476A/T位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。CMS組血漿PC水平低于對照組(P<0.05)。結論 PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點多態性與CMS的易感性之間存在一定關系，可根據基因多態性對CMS易感人群進行篩選，進而有效預防CMS的發生。

高原病；蛋白C；等位基因；多態性，單核苷酸

羅偉，崔森，冀林華，等.蛋白C基因多態性及血漿蛋白C水平與慢性高原病易感性的關系研究[J].中國全科醫學，2017，20(21)：2618-2622.[www.chinagp.net]

LUO W，CUI S，JI L H，et al.Association of protein C gene polymorphisms and plasma protein C levels with the susceptibility to chronic mountain sickness[J].Chinese General Practice，2017，20(21)：2618-2622.

慢性高原病(CMS)是高原居住人群對高原低氧低壓不耐受產生的一系列臨床體征[1]，主要的病理特征為紅細胞增多及嚴重的低氧血癥。患者血液黏滯度增高，血流緩慢，呈現血栓前狀態(PTS)，繼而發生血液、呼吸、循環、神經、消化、泌尿系統等全身各臟器的系統性疾病[2]，并且隨著海拔高度的增加，發病率也逐漸增高[3]。目前有關CMS的發病原因，學術界普遍認為高原習服失衡是其根本原因，高原特殊的低氧低壓環境容易引起通氣過度、電解質失衡、血液改變，進而引起高原難以習服[4-5]。通常非高原居住者來到高原以后多會發生CMS癥狀，而世居高原的居民則會自然習服，在高原進行正常的生命活動，而這意味著高原世居者可能已發生基因改變[6]。本研究以人類蛋白C(PC)基因為研究方向，取基因序列中單核苷酸多態性位點，并檢測血漿PC水平，探究PC與CMS的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月—2015年10月移居青海省玉樹藏族自治州玉樹縣(海拔3 600～3 700 m)青年男性漢族CMS患者30例為觀察組，平均年齡(37.4±7.2)歲；平均移居時間(1.7±0.7)年。同期移居而未發生CMS的青年男性漢族健康志愿者30例為對照組，平均年齡(36.8±8.0)歲；平均移居時間(1.8±0.6)年。兩組受試者年齡(t=0.442)、移居時間(t=0.761)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經青海大學附屬醫院倫理委員批準，受試者均對本研究知情同意。

1.2 CMS患者的納入標準 (1)均符合2004年第六屆國際高原醫學和低氧生理學術大會制定的相關診斷標準[7]；(2)移居青海1年以上；(3)除CMS外無其他疾病；(4)無家族性遺傳疾病。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 所有受試者禁食12 h后于清晨采集空腹靜脈血，EDTA抗凝，低溫(-20 ℃)保存，所有血樣采集完畢后參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.2 PCR擴增和直接測序 從NCBI數據庫下載PC基因序列(NC 000002.11)，應用軟件Primer 5.0設計引物，同時在GeneBank中進行同源性比對，挑選最佳引物對，最后確定引物對為5′-ATTGGGATGGCATGTC ATTG-3′和5′-CCCTGGCTGGAGGATTCAG-3′，采用Bio-Rad Mycycler PCR擴增儀進行目的基因片段擴增。PCR反應體系：基因組DNA 200 ng，引物對各20 pmol，10×Taq buffer 5 μl，dNTP mix 4 μl，TaKaRa+Taq酶2.5 U，滅菌雙蒸水補足至50 μl。PCR相關試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3.3 基因多態性分析 對PCR產物進行純化后，采用Mutation Surveyor軟件與PC基因序列比對分析，篩選Mutation Surveyor軟件指出的測序結果與參考序列不一致之處，判斷該樣本是否發生PC基因突變，并觀察PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T位點多態性。

1.3.4 血漿PC水平檢測 采用固相雙抗體夾心ELISA法檢測血漿PC水平。

2 結果

2.1 兩組PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點Hardy-Weinberg平衡檢驗結果 將所有受試者PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點等位基因和基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示，CMS組χ2值分別為0.069、0.296、0.097，P值分別為0.789、0.735、0.756；對照組χ2值分別為0.368、0.315、0.021，P值分別為0.575、0.683、0.897，表明所選擇的群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態。2.2 兩組PC基因-1654C/T位點多態性比較 兩組PC基因-1654C/T位點基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC基因-1654C/T位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1、圖1)。

表1 兩組PC基因-1654C/T位點多態性比較〔n(%)〕

注：CMS=慢性高原病

圖1 兩組PC基因-1654C/T位點多態性

2.3 兩組PC基因-1641A/G位點多態性比較 兩組PC基因-1641A/G位點基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC基因-1641A/G位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2、圖2)。

2.4 兩組PC基因-1476A/T位點多態性比較 兩組PC基因-1476A/T位點基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組PC基因-1476A/T位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3、圖3)。

表2 兩組PC基因-1641A/G位點多態性比較〔n(%)〕

圖2 兩組PC基因-1641A/G位點多態性

組別例數基因型AA AT TT等位基因A T對照組30 2(6.67) 28(93.33)045(75.00)15(25.00)CMS組3011(36.67)19(63.33)048(80.00)12(20.00)χ2值7.9540.430P值0.0050.512

圖3 兩組PC基因-1476A/T位點多態性

2.5 兩組血漿PC水平比較 CMS組血漿PC水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表4 兩組血漿PC水平比較

3 討論

PC是由肝臟合成的一種維生素K依賴性糖蛋白[8]，為抗凝系統中的關鍵成分，人類PC基因位于2號染色體(2q14～21),長11.2 Kb，有8個外顯子，7個內含子，由419個氨基酸殘基組成，相對分子量為62 KD，正常人血漿PC水平為3～5 mg/L。PC本身是絲氨酸蛋白酶原，其激活劑為凝血酶，激活實質是一個酶解過程，即裂解重鏈N2H末端精氨酸(Arg)-異亮氨酸(Ile)肽鍵，解離下一個12肽而活化[9]。PC被激活成為活化PC(APC)后發揮抗凝作用：(1)滅活FⅤa和FⅧa。APC在磷脂及Ca2+參與下，裂解FⅤa及FⅧa重鏈，使FⅤa及FⅧa失活，阻止了凝血酶的形成。(2)阻礙FⅩa與血小板結合。血小板表面存在著FⅩa受體(FⅩaR)，當FⅩa與FⅩaR結合后可使FⅩa活性極大增強。(3)促進纖維蛋白溶解。APC能刺激內皮細胞釋放組織型纖溶酶原激活物(t-PA)等纖溶物質，同時滅活纖溶酶原活化物抑制劑-1(PAI-1)，激活纖溶系統，促進纖維蛋白溶解。既往研究發現，低氧可使機體凝血機制發生紊亂，認為低氧時機體抗凝血系統PC水平降低，導致患者血液黏滯度進一步增加，考慮PC的降低是導致CMS發生、發展的病理基礎之一[10]。自1981年發現了第1個PC基因突變以來，截至2013年1月，在人類基因突變庫中登記的PC基因突變已有262種[11]。突變類型主要有單堿基替代、缺失/插入、剪切位點突變和啟動子區突變等，突變分布于PC基因的各個區域。有研究發現多數CMS患者存在PC基因啟動子區-1654C/T、-1641A/G及5′-非翻譯區-1476A/T位點的多態性[12-13]，并發現PC基因該區域-1654C/T、-1641A/G和-1476A/T位點的多態性可能與血漿PC水平有關[14-15]。啟動子區一般位于基因表達的調控區，該區域的改變可導致順式作用元件的改變，從而引起基因表達水平的改變。如果單核苷酸多態性存在于基因表達的調控區，其能改變基因的表達水平，從而對表型產生明顯影響。5′-非翻譯區包括外顯子1和21 bp顯子2，該區域不編碼，導致PC基因轉錄起始部位與翻譯起始密碼子分離，該區域及其鄰近的基因變異同樣可能影響基因的表達調控[16]。

本研究采用PCR直接測序法檢測PC基因序列中位于啟動子區-1654C/T、-1641A/G及5′-非翻譯區-1476A/T單核苷酸多態性位點在高原漢族男性移居人群CMS患者以及相應的健康人群的基因頻率分布，以探討PC基因多態性與CMS的相關性。首先，CMS組和對照組PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T 3個位點等位基因和基因型的觀察值和期望值吻合良好，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所選人群具有群體代表性。此外，兩組PC基因-1654C/T、-1641A/G、-1476A/T位點基因型頻率間均有差異，表明PC基因多態性與CMS易感性存在一定關系。本課題采用固相雙抗體夾心ELISA法檢測血漿PC水平，結果顯示，CMS患者血漿PC水平明顯低于對照組，與前期實驗結果[17]相吻合。

綜上所述，PC基因-1654C/T、-1641A/G及-1476A/T位點多態性與CMS的易感性之間存在一定關系。本課題初步得出PC基因-1654C/T、-1641A/G以及5′-非翻譯區-1476A/T位點多態性及血漿PC水平與CMS的易感性關系，從基因水平更深刻的闡明CMS發生的差異原因和內在機制，通過遺傳標記的檢測，進一步揭示CMS發生的遺傳背景，對采取有效的群體預防措施，預防CMS發生具有重要意義，為促進高原地區經濟和社會發展提供強有力的理論和實踐指導。

作者貢獻：羅偉、崔森、冀林華進行文章的構思與設計；羅偉、冀林華、王紅心進行研究的實施與可行性分析；李玉麗、馬曉靜、馬婕收集數據；羅偉、馬曉靜整理數據；羅偉、冀林華進行統計學處理；羅偉、崔森、冀林華分析并解釋結果；羅偉、冀林華、馬曉靜撰寫論文；羅偉、崔森、冀林華進行論文修訂；羅偉、冀林華負責文章的質量控制及審校；羅偉對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

本研究局限性：

(1)進一步增加樣本量進行群體遺傳學的研究，盡量減少由于樣本量少而發生信息偏倚。(2)當通過病例-對照研究已揭示在人群水平上某標記位點與某些性狀(如疾病)存在某種關聯性時，在未來進一步研究中可選擇以受累家系為基礎的內在對照組(由雙親及同胞組成)，進行單倍型相對風險率分析(HRR)及傳遞/不平衡試驗(TDT)，以排除可能的虛假關聯。(3)慢性高原病發生率明顯存在種族差異，青海地域廣闊、氣候復雜、民族眾多,可進一步研究蛋白C等位基因的分布頻率在不同民族之間的差異。

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(本文編輯：毛亞敏)

Association of Protein C Gene Polymorphisms and Plasma Protein C Levels with the Susceptibility to Chronic Mountain Sickness

LUOWei*，CUISen，JILin-hua，WANGHong-xin，LIYu-li，MAXiao-jing，MAJie

DepartmentofHematology,QinghaiUniversityAffiliatedHospital,Xining810001,China

*Correspondingauthor:LUOWei,Associateprofessor，Associatechiefphysician，Mastersupervisor；E-mail：luoweili992@126.com

Objective To explore the association of protein C(PC) gene polymorphism and plasma PC levels with the susceptibility to chronic mountain sickness(CMS).Methods This study was conducted in 60 young males of Han nationality who moved to Yushu County,Yushu Zang Autonomous Prefecture,Qinghai Province from January 2014 to October 2015,including 30 cases with CMS(CMS group),and 30 healthy cases without CMS volunteered for this study(control group).PCR-direct sequencing was used to detect the PC gene polymorphism at the -1654C/T,-1641A/G and -1476A/T loci.Plasma PC levels were determined by ELISA.Comparisons were made between the groups in terms of the PC gene polymorphisms at the three loci and plasma PC levels.Results Significant differences were found between the two groups in the PC gene polymorphism genotype frequencies at the -1654C/T locus(P<0.05),but not in PC gene polymorphism allele frequencies at it(P>0.05).The PC gene polymorphism genotype frequencies at the -1641A/G locus differed significantly between the two groups(P<0.05),while the PC gene polymorphism allele frequencies at it did not(P>0.05).Notable differences were found between the two groups in terms of the PC gene polymorphism genotype frequencies at the -1476A/T locus(P<0.05),but not in PC gene polymorphism allele frequencies at it(P>0.05).The plasma PC levels in CMS group were lower than those in the control group(P<0.05).Conclusion PC polymorphisms at the -1654C/T,-1641A/G and -1476A/T loci genetic loci -1654C/T,-1641A/G and -1476A/T may be associated with the susceptibility to CMS.Therefore,in order to prevent CMS,PC polymorphisms measured can be used for identifying the susceptible population of CMS.

Altitude sickness；Protein C;Alleles；Polymorphism,single nucleotide

青海省科技廳國際合作項目(2014-HZ-808)；青海大學附屬醫院中青年科研基金項目(ASRF-2013-12)

R 594.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.21.012

2017-03-02；

2017-06-03)

810001青海省西寧市，青海大學附屬醫院血液科

*通信作者：羅偉，副教授，副主任醫師，碩士生導師；E-mail：luoweili992@126.com