miRNA-10a對小鼠肝纖維化細胞增殖及TGFβ1/Smads信號轉導通路表達的影響

鄧國孫，李鎮伽

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·基礎醫學· ·論著·

miRNA-10a對小鼠肝纖維化細胞增殖及TGFβ1/Smads信號轉導通路表達的影響

鄧國孫，李鎮伽

目的 通過觀察肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)小鼠肝組織TGFβ1/Smads信號轉導通路的表達與HF進展的關系，探討微小RNA(microRNA，miRNA)-10a對于HF的作用機制。方法 選用9周齡健康雄性小鼠(C57BL6/J)40只，按照數字表法隨機分為對照組和HF模型組(觀察組)，對照組生理鹽水5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周；觀察組10% CCL4橄欖油5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周，制作小鼠HF模型。RT-PCR法檢測HF細胞中miRNA-10a表達后，將觀察組HF細胞進行培養及miRNA-10a模擬物轉染(轉染組)，CCK-8法檢測HF細胞增殖能力，Western blotting檢測HF細胞中TGFβ1、Smad7的表達水平。結果 與對照組比較，觀察組miRNA-10a表達水平明顯增加(P<0.05)；與對照組比較，轉染組肝細胞miRNA-10a表達水平明顯降低(P<0.05)；與對照組相比，低表達miRNA-10a明顯降低觀察組TGFβ1的表達水平，提高Smad7的表達水平(均P<0.05)。結論 小鼠HF細胞中低表達miRNA-10a，轉染miRNA-10a模擬物可明顯促進小鼠HF細胞增殖，其作用機制是通過miRNA-10a調控TGFβ1/Smads信號轉導通路促進小鼠HF。

肝纖維化；轉化生長因子β1；Smad7蛋白；TGFβ1/Smads信號轉導通路

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是機體對各種原因誘發的慢性肝細胞損傷后的一種自我修復反應。有研究[1]顯示，HF是一個可逆的病理生理過程，消除相關致病因素或有效的早期干預治療可改善HF程度，反之則可進展為終末失代償期肝硬化。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類大小為18～22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA完全或不完全互補配對，引起mRNA降解或翻譯抑制，從而能在轉錄后水平調控機體基因的表達[2]。有研究[3]顯示，一些miRNA在肝細胞內表達相對豐富，并在疾病的進展中表達有明顯差異，從而影響肝臟疾病的發生發展。也有研究[4-5]表明，miRNA-10a參與造血細胞的分化、腫瘤的發生發展、免疫功能的調節等多個病理生理過程。在博萊霉素所致的肺纖維化小鼠肺組織中，發現了161個差異表達的miRNA，其中miRNA-10a通過調節TGF-β信號通路參與調控纖維母細胞激活和膠原沉著[6]。有文獻[7]報道，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活或表型轉化為成纖維細胞是HF形成的中心環節，轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)是公認的最強致HF的細胞因子之一[8]，Smad蛋白是TGFβ1關鍵的作用底物[9]，可誘發HSC激活，啟動膠原基因表達，從而導致HF的發生。TGFβ1/Smads信號轉導通路的激活及引起的相應病理變化, 在HF的發生發展中具有非常重要的意義[10]。本研究探討miRNA-10a調控HF的分子機制，并將miRNA-10a作為HF藥物靶點，從而指導HF的診斷與治療。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 Pronase E購于美國Merck公司，Collagenase II購于美國Sigma公司，淋巴細胞分離液購自中科院生工所，DMEM培養液及干粉購于GIBCO公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，Interferin siRNA轉染劑購自Polypus公司，miRNA分析系統購自Applied 公司，PrimeScript RT-PCR反轉錄試劑盒購自TOYOBO公司，miRNA-10購于廣東銳博公司，各類單抗均購于美國Abcam公司，細胞裂解液CLB購自Cell Signaling T公司。

1.2 建立HF小鼠模型 選用9周齡健康雄性小鼠(C57BL6/J)40只，體質量19～22 g，按照隨機數字表法分為對照組和HF模型組(觀察組)，對照組生理鹽水5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周；觀察組10% CCL4橄欖油5 μl/g腹腔注射，每周2次，注射8周，制作小鼠HF模型。

1.3 制備標本 實驗小鼠禁食12 h，在乙醚麻醉下，斷頭取血，部分肝臟組織采用10%中性甲醛固定，備制病理切片，其余肝組織液氮快速冷凍，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.4 HSC分離 75%酒精消毒腹部皮膚后，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)小鼠腹腔注射，十字切口開腹，充分暴露小鼠心臟和下腔靜脈，18號套管針連接輸液瓶，從左心室進針注入灌注液，下腔靜脈放血，10 ml/min流速肝臟灌流，直至肝臟變為土黃色，隨后采用酶灌注液繼續灌流14～18 min，直至肝臟呈現爛泥狀，取肝臟，生理鹽水沖洗后，剔除肝臟包膜及結締組織，剪碎后加入振蕩消化液，37 ℃振蕩20 min，200×g離心5 min，細胞懸液經300目鋼網過濾后，收集于2個30 ml離心管中,1 400×g離心5 min，棄上清，D-Hanks液重懸沉淀，取上清進行梯度分離。采用淋巴細胞分離液鋪梯度，上層加充分消化的單細胞懸液，25 ℃，1 500×g離心25 min，平拋離心后的分離細胞，小心吸出中層少量白色液體，即為HSC。DMEM制備，1 400 ×g離心10 min，洗滌2次，以1.0×106個細胞接種于100 ml塑料培養瓶中24 h，靜置培養72 h后換成含10%胎牛血清DMEM培養液，每3 d更換培養液1次。采用臺盼藍進行染色，計算細胞成活率，以2組小鼠HSC成活率均達到90%以上表示分離成功。

1.5 Real-time PCR檢測miRNA-10a表達 采用TRIzol試劑，提取2組肝組織總RNA，利用SYBR Premix ExTaq熒光定量PCR試劑盒及LightCycler儀器，進行操作及分析。miRNA-10a逆轉錄引物序列：5’-GTCGTATC-CAGCAGGGTCCGTATTCGCACTGGATACGACACA-3’；miRNA-10a定量引物上游序列：5’-ACGTACCTGTAGATCCG-3’，引物下游序列：5’-GTG-CAGGTCCGAGGT-3’。U6逆轉錄引物序列：5’-CGCTCACGAATTTGCGTGTAT-3’；U6定量引物上游序列：5’-CTCGCTTCGCAGCACA-3’，引物下游序列：5’-AACGCTTCACGAATTTCGT-3’。按3步法進行DNA擴增，反應條件：95 ℃、20 s；94 ℃、25 s；55 ℃、15 s；75 ℃、10 s；40次循環條件：72 ℃、10 min。每次Real-timePCR被測標本的Ct值減去對應樣品中U6Ct值，即為ΔCt，HF細胞中miRNA-10a的表達量采用2-ΔΔCt計算，HF組織標本中miRNA-10a表達量采用log22-ΔΔCt計算。

1.6 HF細胞培養和miRNA-10a模擬物轉染 小鼠HF細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱進行傳代培養。將處于對數期生長的HF細胞接種于12孔板，每孔細胞密度為3×105個，當細胞生長融合度至50%時，再將其分為2組，一組為miRNA-10a模擬物轉染組，一組為對照組，分別用含有miRNA-10a模擬物和對照miRNAOpti-MEM培養基轉染細胞，同時加入Interferin提高轉染率。轉染時每孔miRNA-10a模擬物或對照miRNAOpti-MEM的終濃度均為20 nmol/L，Interferin為4 μl，轉染72 h。本實驗重復3次。

1.6 CCK-8法檢測HF細胞的增殖能力 根據CCK-8試劑盒說明書操作，HF細胞轉染miRNA-10a模擬物或對照miRNA Opti-MEM 72 h后，將2組細胞根據每孔2×104個，接種于96孔培養板中，并各設置3個平行孔，3～5 h后細胞貼壁，加入100 μl 1640培養液、10 μl CCK-8，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養2 h，酶標儀測定光密度(D)值。本試驗重復3次。

1.7 Western blotting檢測HF細胞中TGFβ1、Smad 7蛋白的表達 HF細胞轉染72 h后，收集轉染組和對照組待測細胞，細胞裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白經8% SDS-PAGE分離后，轉至PVDF膜，25 ℃封閉1 h，分別加入TGFβ1抗體(1∶2 000)、Smad 7抗體(1∶2 000)、β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加過氧化物酶標記的二抗，25 ℃孵育1h，洗膜后ECL法顯影，Gene gnome采集圖片，利用Image J軟件進行灰度分析。本試驗重復3次。

1.8 統計學處理 采用SPSS 18.0統計學軟件，數據以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-10a在小鼠HF中高表達 Real-time PCR檢測觀察與對照組中miRNA-10a相對表達量，結果顯示，觀察組HF組織中miRNA-10a表達量明顯高于對照組[(-7.84±1.38)vs(-9.97±1.59)，P<0.05]。

2.2 轉染miRNA-10a模擬物后HF細胞miRNA-10a的表達 Real-time PCR檢測轉染組及對照組中miRNA-10a的相對表達量，結果(圖1)顯示，轉染組(miRNA-10a mimics)HF細胞miRNA-10a表達量明顯低于對照組(P<0.01)。

注：與對照組比較aP<0.01圖1 Real-time PCR檢測2組肝細胞miRNA-10a表達水平

2.3 低表達miRNA-10a促進HF細胞增殖 為了研究低表達miRNA-10a對HF細胞增殖的影響，利用CCK-8法檢測轉染組及對照組HF細胞的增殖水平，結果(圖2)顯示，與對照組相比，低表達miRNA-10a的HF細胞增殖水平明顯提高(P<0.05)。

注：與對照組比較aP<0.05圖2 CCK-8法檢測轉染組及對照組HF細胞的增殖情況

2.4 miRNA-10a調控TGFβ1/Smads信號轉導通路 Western blotting檢測轉染miRNA-10a模擬物后HF細胞中TGFβ1、Smad 7蛋白的表達，結果(圖3)顯示，與對照組比較，轉染組TGFβ1蛋白的表達量明顯降低(P<0.05)，顯示miRNA-10a上調HF細胞中TGFβl表達，而轉染組Smad 7蛋白的表達量顯著增多(P<0.05)，顯示miRNA-10a下調Smad 7蛋白的表達。

注：與對照組比較aP<0.05圖3 Western blotting檢測miRNA-10a對TGFβ1/Smads表達的影響

3 討論

有研究顯示[11-12]，TGFβ1及其Smad信號轉導通路與HF的發生發展密切相關，其中TGFβ1為雙硫鍵結構的二聚體堿性蛋白，是激活HF細胞的主要細胞因子，也是最強的HF促進劑[13]；Smad蛋白是目前發現的TGFβ家族受體激酶的關鍵作用底物之一，根據其結構和功能的不同分為3類，其中抑制型Smad蛋白中的Smad 7主要功能為抑制TGFβ的轉導通路。Smad 7可與活化的TGFβ1受體結合，抑制Smad蛋白磷酸化；進入胞漿Smad 7，使Smad蛋白不能與其受體相結合，在TGFβ信號轉導中形成負反饋環路，從而發揮抗HF作用[14]。

研究[15-17]顯示，miRNA參與HF的發生發展，但關于miRNA調控HF的分子機制還不是很清楚。miRNA-10a作為miRNA家族中成員之一，本研究顯示，miRNA-10a在小鼠HF組織中高表達，并且低表達miRNA-10a能夠促進HF細胞增殖，進一步表明miRNA-10a在HF中發揮著促纖維化因子的作用。本研究同時發現，與對照組相比，轉染組TGFβ1蛋白表達明顯降低，表明miRNA-10a上調TGFβ1的表達；而轉染組Smad 7蛋白表達顯著增多，表明miRNA-10a能夠下調Smad 7表達，說明miRNA-10a通過調控TGFβ1/Smads信號轉導通路發揮促HF作用，這為HF的治療提供了潛在的治療靶點。

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(本文編輯：王映紅)

Effects of miRNA-10a on the proliferation of hepatic fibrosis cells and the expression of TGF beta 1/Smads signal transduction pathway in mice

DengGuosun,LiZhen′ga

(DepartmentofGastroenterology,ChongmingBranch,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China)

Objective To investigate the possible mechanism involved in the effect of micro RNA-10a(miRNA)on hepatic fibrosis (HF), through the observation on the expression of TGFβ1/Smads signal transduction pathway in mice with HF and its correlation with the development of hepatic fibrosis.Methods Forty healthy male mice with an age of 9 weeks (C57BL6/J) were randomly divided into the control group and the HF model group (or the observation group). The animals in the control group were given normal saline abdominally at a dosage of 5 μl/g, twice a week, for a succession of 8 weeks, while the animals in the observation group received 10% CCL4 olive oil also at a dosage of 5 μl/g with the same frequency and for the same length of time to develop the model of hepatic fibrosis. The expression of miRNA-10a was detected by RT-PCR. HF cells were cultured in the animals of the observation group and miRNA-10a mimics were transfected (the transfection group). CCK-8 method was used to detect the proliferation of HF cells, and the expression levels of TGFβ1 and Smad 7 in the HF cells were detected by Western-blotting. Results As compared with that of the control group, the expression level of miRNA-10a in the observation group was increased significantly (P<0.05); and as compared with that of the control group, the expression level of miRNA-10a in the transfection group were significantly decreased (P<0.05); and furthermore, as compared with that of the control group, the lower expression of miRNA-10a significantly decreased the expression level of TGFβ1 and increased the expression level of Smad 7(P<0.05).Conclusion The expression of miRNA-10a in the HF cells was lower, and the transfected miRNA-10a mimics could significantly promote the proliferation of HF cells, the possible mechanism of which might be associated with the regulation of TGFβ1/Smads signal transduction pathway in HF promotion.

Hepatic fibrosis; Transforming growth factor β1; Smad 7 protein; TGFβ1/Smads signal pathway

202150 上海，上海交通大學附屬新華醫院崇明分院消化內科(鄧國孫)；南昌大學醫學院第二附屬醫院普外科(李鎮伽)

R575.3

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.03.013

2016-10-27)