草魚腸道細菌CD-17的鑒定和生防活性研究

楊敬輝，王敬根，張玉軍，莊義慶

(江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容 212400)

草魚腸道細菌CD-17的鑒定和生防活性研究

楊敬輝，王敬根，張玉軍，莊義慶

(江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容 212400)

為篩選新的生防菌種，采用平板對峙培養法測定分離自草魚腸道細菌CD-17菌株對常見植物病原真菌的抑菌譜。通過菌株形態學掃描電鏡觀察、平板培養生理生化特性和分子輔助分類法確定其分類地位，同時對其活菌制劑(BCA)進行溫室防效試驗。結果表明，CD-17對供試植物病原真菌均有不同程度的抑制作用；溫室控制條件下，BCA與炭疽病菌分生胞子懸浮液(GC)同時接種正常草莓葉片和接種GC 48 h后再用BCA的控制效果分別為100%和55.68%；BCA與GC同時接種有微傷口的草莓葉片和接種GC 48 h后再用BCA的控制效果分別僅為76.94%和37.82%。根據菌株形態觀察、生理生化特征、16Sr DNA 基因和gyrB基因序列比對分析，鑒定該菌株為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

草魚腸道細菌；生防活性；菌種鑒定

炭疽病菌(Glomerellaspp.)侵染引發的病害是江蘇省夏季草莓露天育苗和冬季塑料大棚移栽早期的主要病害。草莓炭疽病主要采用化學藥劑防控，近年來常用的殺菌劑有多菌靈(Carbendazim)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、咪鮮胺(Prochloraz)、吡唑嘧菌酯(Pyraclostrobin)和咯菌腈(Fludioxonil)等。江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所通過連續3 a對江蘇省多地大棚草莓和葡萄炭疽病菌對常規使用化學藥劑的敏感性檢測結果表明，草莓炭疽病菌對多菌靈和嘧菌酯已產生抗藥性，且抗性菌株種群占比逐年上升，尤其關注的是炭疽病菌對特效新藥劑吡唑醚菌酯也產生抗藥性[1]。

在草莓生產全程中完全可以通過系統的農業、物理和生物防控措施來控制草莓病害，而生防措施中使用活性芽胞類制劑是主要手段。目前，國內外還沒有成功登記用于防治草莓炭疽病的生物農藥專用制劑。研究大多集中于防治草莓再植病害，報道的有木霉菌屬真菌(Trichodermaspp.)[2-4]、芽胞桿菌屬細菌(Bacillusspp.)[5-10]、假單胞菌屬細菌(Pseudomonasspp.)[11-12]和酵母菌屬[13-15]等。

草莓是即采即食的應時鮮果，加之田間交替開花采果，所以對采收期化學藥劑的選擇和安全使用有很大的局限性。因此，篩選研制有效、安全的生物菌劑，對設施高效經濟作物有很大必要性。筆者先后從杜鵑、牛胃和草魚腸道微生物菌群中篩選得到一批適宜于中溫生長、對植物病原真菌具廣譜抑菌活性的菌株。本研究用分子分類的方法對分離自草魚腸道的CD-17菌株進行確定，并在溫室條件下研究其發酵活菌制劑對草莓炭疽病的生防活性，旨在為該菌株的后續研究與開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 指示病原真菌 梨黑星病菌(Venturiapiritna)，草莓炭疽病菌(Glomerellafragariae)，草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)，葡萄炭疽病菌(Glomerellacingulata)，葡萄房枯病菌(Physalosporabaccae)，葡萄穗軸褐腐(枯)病菌(Altednariaviticola)，葡萄黑痘病菌(Elsinaeampelina)，葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)，稻紋枯病菌(Thanatephoruscumumeris)，稻惡苗病菌(Gibberellafujikurio)，稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)，小麥赤霉病菌(Gibberellazeae), 小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacereal)，棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)，蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)，油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)。

1.1.2 供試培養基 PDA培養基：用于植物病原指示菌的培養。R2A培養基：每1 000 mL蒸餾水中含酵母粉0.5 g、酪蛋白胨0.25 g、肉蛋白胨0.25 g、水解酪蛋白0.5 g、葡萄糖0.5 g、淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、磷酸氫二鉀0.3 g、水合硫酸鎂0.024 g、瓊脂15 g、pH 7.2，用于細菌的分離和純化。WA培養基：每1 000 mL蒸餾水中含蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、酵母提取物3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g，用于頡頏細菌的篩選。FM培養基：20 L 水中含大豆粉100 g、馬鈴薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO320 g、MnSO41 g，用于菌種上罐發酵。

1.2 CD-17菌株抑菌譜的測定

采用“平板對峙培養法”測定抑菌譜。先將CD-17菌株接種于含25 mL WA培養基的平板(d=9 cm)正中心，同一平板上再接種事先在PDA平板上長好的指示植物病原菌菌片(d=4 mm)，每個平板內接種3片，使接種的3片植物病原菌中心到CD-17菌株的中心均為2 cm。對照不接種CD-17菌株，每菌株設4個重復，待對照長滿平板時測量抑菌圈半徑并計算出平均抑菌半徑，抑菌半徑用“平均數±標準差”表示。

1.3 CD-17菌株的鑒定

1.3.1 掃描電鏡觀察 掃描電鏡觀察委托揚州大學中心實驗室完成。

1.3.2 菌株生理生化特征 生理生化特征參照東秀珠等[16]的方法測定。

1.3.3 菌株16S rDNA基因序列測定 CD-17菌株基因組DNA的提取及16S rDNA序列測定方法參照楊敬輝等[17]的方法。

1.3.4gyrB基因序列測定及序列的系統發育進化分析 參照喻國輝等[18]的方法。

1.4 CD-17菌劑的加工

1.4.1 菌液的獲得 挑取事先在R2A培養基上劃線培養好的CD-17菌株單菌落斑，接種于裝有5 mL PDA液體培養液的三角瓶(V=20 mL)中，于30 ℃、200 r/min振蕩培養16 h；將所得培養液5 mL全部接種于裝有400 mL PDA培養液的三角瓶(V=1 000 mL)中，30 ℃、200 r/min振蕩培養16 h；所得400 mL培養液接種于裝有20 L FM培養液的發酵罐(V=30 L，鎮江東方GUS-30)中，設置發酵條件為：溶氧100%，攪拌速度為350 r/min，發酵溫度33 ℃，發酵時間30 h，自動酸堿流加控制pH為6.6～7.0。

1.4.2 菌劑加工工藝 將“1.4.1”中的發酵液離心(8 000 r/min)后用φ=20 %丙三醇溶液(溶液用無菌水配制)重新懸浮，測定懸浮液的活芽胞含量，根據測定結果用φ=20 %丙三醇溶液調節懸浮液的活芽胞數至1.0×1010cfu/mL，并按5 g/L的用量加入黃原膠攪拌均勻，得成品懸浮劑的濃度約為1.0×1010cfu/mL(BCA)，置4 ℃保存，備用。

1.5 BCA對草莓炭疽病的溫室防治試驗

1.5.1 參試草莓苗的準備 挑選同一生育期、無病、大小一致的草莓苗(每株苗只留3個莖枝)，移栽于裝有550 gw(滅菌土)∶w(細沙) ∶w(無菌基質)= 5∶4∶1的黑色塑料盆缽(缽體h=8 cm，缽口d=10 cm，缽底d=8 cm)，移栽定植14 d 后用于試驗。

1.5.2 接種用炭疽病菌分生孢子懸浮液(GC)的制備 用φ=1%吐溫20的無菌水，分別將事先在PDA平板上培養好的炭疽病菌桔黃色分生孢子堆洗下，充分振蕩混勻，在顯微鏡下用血球計數板計數，調整胞子密度，本研究中實際用于接種的炭疽病菌分生孢子貯藏液的密度為2.67×105mL-1(GC)。

1.5.3 草莓炭疽病菌的防治試驗 試驗共設5個處理，即處理A用無菌水將上述BCA制劑稀釋成芽胞濃度約為1.0×107cfu/mL，噴霧于16缽草莓苗，待菌液風干后再用噴霧接種GC，保濕培養箱培養48 h后置于溫室，設16缽接種GC但不噴霧BCA的對照(CK1)；處理B用00#號昆蟲針在草莓葉片的正中心刺6個微傷口后，立即噴霧BCA于16缽草莓苗，待菌液風干后再噴霧接種GC，保濕培養箱培養48 h后置于溫室，設16缽帶傷口草莓且接種GC但不噴霧BCA的對照(CK2)；處理C用00#號昆蟲針在每片葉子的正中心刺6個微傷口后，立即用GC接種16缽草莓苗，保濕培養箱培養48 h后再噴霧BCA，風干后置于溫室，對照同CK2；處理D用GC接種16缽草莓苗，保濕培養箱培養48 h后再噴霧BCA，風干后置于溫室，對照同CK1；處理E分別設不接種GC也不噴霧BCA的16缽草莓健苗(CK3)和帶微傷口的草莓苗(CK4)。

1.5.4 防效計算 于病原菌接種7 d后記錄各處理病害嚴重度并計算出病情指數。發病葉片分級標準：0級，葉片無病斑；1級，病斑直徑<5 mm；2級，病斑直徑6～10 mm；3級，病斑直徑11～15 mm；4級，病斑直徑>15 mm。每缽草莓記錄3個莖枝(共9個葉片)，新長出的葉片不計入總葉片數，同一葉片上有多個病斑時只記錄最大病斑的直徑。病情指數按下列公式計算：病情指數=∑(各級葉片數×級值)/(調查總葉片數×最高病級)×100。

1.6 試驗條件

保濕培養箱條件：光照7 500 lx，28 ℃，濕度95% RH,光暗比為12 h∶12 h。

溫室條件： 光照10 000 lx，溫度白天控制在26～28 ℃，晚上控制在20～22 ℃，光暗比為12 h∶12 h。

1.7 說 明

文中的菌種及其制劑的加工方法已申請專利保護。

2 結果與分析

2.1 CD-17菌株的抑菌譜

對峙培養法測定結果表明，CD-17菌株對所有指示病原菌都有較強的頡頏活性(表1)。其中對水稻稻瘟病菌、紋枯病菌、核盤病菌和草莓炭疽病菌的抑菌半徑超過15 mm。抑菌測定結果明確CD-17菌株具有生防潛力。

表1 CD-17菌株對植物病原菌的抑菌活性Table 1 Inhibition activity of strain CD-17 against phytopathogens mm

2.2 CD-17菌株的鑒定

掃描電鏡觀察表明，CD-17菌株的細胞形態為近圓柱體、桿狀，菌體大小為(1.0～1.3)μm×(2.7～3.2) μm(圖1)。生理生化測定結果顯示，CD-17菌株為好氧、產芽胞(表2)，不能在50 ℃條件下生長，V-P試驗為陽性，可利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和乳糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，發酵葡萄產氣、不產酸。結合CD-17菌株16S rDNA基因序列的BLAST比對結果，選擇序列比對相似度在99%～100%的12個報道菌株構建系統發育樹(圖2)，以E.coli菌株的16S rDNA基因序列為外參。16S rDNA基因序列分析結果可將CD-17明確的歸類為芽胞桿菌屬。同樣的方法以gyrB基因序列比對結果構建系統發育樹，將CD-17進一步歸類為Bacillusamyloliquefaciens(圖3)。綜合掃描電鏡、菌株生理生化和分子生物學輔助鑒定結果，把CD-17菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌。

圖1 CD-17菌株掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope images of strain CD-17

2.3 溫室防治

在溫室控制條件下，當炭疽病菌分生孢子與BCA同時接種時，7 d的防治效果為100%，但當病原菌分生孢子先接種48 h后再用BCA的防治效果為55.68%。當草莓葉片在人工給予微傷口時，病原菌分生孢子與BCA同時接種7 d的防治效果為76.94%，當病原菌分生孢子先接種48 h后再防治時的防治效果為37.82%(表3)。

表2 CD-17菌株的細胞形態及理化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain CD-17

圖2 基于16S rDNA基因序列BLAST結果構建菌株CD-17的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CD-17 based on BLAST results of 16S rDNA gene sequence

3 討 論

炭疽病菌分生孢子在接種24 h后，接種前給予微傷口的草莓葉片上有典型的病斑，且有傷口的嫩葉發病重于老葉，在48 h保溫保濕后有傷口的草莓植株全部發病，而沒有傷口的依然未表現出明顯的侵染癥狀，接種5 d后沒有傷口的草莓葉片才開始有典型的病斑，在接種7 d后有傷口植株的病斑進一步擴大，但無傷口植株的病斑沒有顯著擴大，接種 14d 后，有傷口植株的葉片上病斑嚴重度極顯著高于無傷口的植株。以上病程觀察結果說明：微傷口有利于草莓炭疽病菌分生孢子的快速侵入，炭疽病菌侵入無傷口的正常草莓植株葉片的顯癥時間為5～7 d，在高溫高濕且有傷口的條件下炭疽病菌能快速侵染草莓植株。綜上得出，在草莓苗床或田間管理期間造成的微傷口，或自然風吹、蟲啃等造成的微傷口是炭疽病菌快速暴發流行的促進因子，這也同時解釋為什么在夏天暴雨和每次摘除老葉過后，露天草莓苗床極易暴發炭疽病的原因。

圖3 基于gyrB基因序列BLAST結果構建菌株CD-17的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain CD-17 based on BLAST results of gyrB gene sequence

處理Treatment草莓葉片無傷口 NormalleafBCA+GCGC48h+BCACK1草莓葉片有微傷口 LeafwithslightwoundBCA+GCGC48h+BCACK2病情指數 Diseaseindex018.9242.7115.4541.6767.01防效/% Controlefficacy10055.68-76.9437.82-

注：BCA指CD-17菌株加工而成的制劑(施用濃度為1.0×107cfu/mL); GC指草莓炭疽菌分生孢子懸浮液(施用密度為2.67×105mL-1)；BCA+GC指噴霧BCA晾干后緊接著接種草莓炭疽病菌分生懸浮液；GC 48 h+BCA指先接種草莓炭疽病菌分生孢子懸浮液并在溫室培養48 h后再噴霧BCA。

Note: BCA represents biocontrol agent prepared from CD-17 strain (Concentration of 1.0×107cfu/mL); GC represents spore suspension of strawberry anthracnose (Concentration of 2.67×105spore/mL); BCA+GC represents BCA and GC inoculated at the same time on strawberry leaf;GC48 h+BCA presents BCA spraying after 48 h inoculation with GC on strawberry leaf.

在江蘇地區，決定露天草莓育苗成功與否的關鍵是控制草莓炭疽病。本研究結果表明，當炭疽病菌侵入草莓葉片后再用生防菌防治的效果僅為37.82%，而未侵入時，即使炭疽病菌的分生孢子接種密度達到105mL-1，保護性防治效果也為100%，說明CD-17能強烈的抑制炭疽病分生孢子的萌發，同時也指出草莓炭疽病的防治重在預防，且防治時間應提前到每次去除老葉前5～7 d左右，而且在去除老葉后還需即時防治1次，該田間防控措施可同時兼治草莓灰霉病和白粉病。按上述方法輔以農業和物理方法集成防治，完全能控制好大棚草莓病害，保證草莓果品安全。本研究中CD-17菌株的菌落形態和平板培養時的菌體顏色、抑菌譜和筆者先前報道的DJ-6菌株(枯草芽胞桿菌)相似，所以為準確確定CD-17菌株的分類地位，參用一些目前常用的分子生物學方法來輔助鑒定。筆者認為，利用芽胞桿菌16S rDNA基因加gyrB基因序列構建菌種親緣關系系統進化樹的方法[18]，能很好確認芽胞桿菌種或種下分類單元。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Biocontrol Activity and Taxonomy of Grass Carp Intestine Bacteria CD-17

YANG Jinghui, WANG Jinggen, ZHANG Yujun and ZHUANG Yiqing

(Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences, Hilly Region of Jiangsu, Jurong Jiangsu 212400，China)

To discover new biological control agents, the biocontrol activity of grass carp intestine bacteria strain CD-17 was interpreted by dual-cultural plate method and greenhouse effect test of CD-17 biocontrol agent (BCA).Based on the morphological, chemical and molecular taxonomy methods, the strain CD-17 was identified.The results showed that the strain CD-17 displayed a broad-spectrum inhibitive activity.Data from greenhouse experiments under the control condition revealed the control efficacy of BCA and spores suspension of strawberry anthracnose (GC) inoculated at the same time and BCA spray after 48 h inoculation with GC on the normal strawberry leaf were 100% and 55.68%, respectively.However, the control efficacy of BCA and GC inoculated at the same time and BCA sprayed after 48 h inoculation with GC on the slight wound strawberry leaf were only 76.94% and 37.82%,respectively.According to the morphological, physiological, biochemical characteristics, 16S rDNA andgyrBgene sequence, the strain CD-17 was identified asBacillusamyloliquefaciens.

Grass carp intestine bacteria; Biocontrol activity; Taxonomic identification

2016-03-04 Returned 2016-03-22

Independent Innovation Foundation of Jiangsu Province[No.cx(13)3062]; Agricultural Science Foundation of Zhenjiang (No.NY2013014,NY2015019);Agricultural Science Foundation of Jiangsu Province(No.BE2013407,BE2015364).

YANG Jinghui, male, Ph.D, Research fellow.Research area: bio-control of plant disease and fungicides resistance.E-mail: yjhnn32@126.com

ZHUANG Yiqing,male, Ph.D, Research fellow.Research area: bio-control of plant disease.E-mail: yqzhuang@sina.com

日期：2017-06-05

2016-03-04

2016-03-22

江蘇省自主創新基金[cx(13)3062]；鎮江市科技支撐(NY2013014，NY2015019)；江蘇省農業支撐(BE2013407,BE2015364)。

楊敬輝，男，研究員，博士，從事植物病害生物防治及植物病原菌抗藥性研究。E-mail: yjhnn32@126.com

莊義慶，男，研究員，博士，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail: yqzhuang@sina.com

S432.44；S476.8

A

1004-1389(2017)06-0932-07

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1728.034.html