HPLC法檢測巧克力中微量異黃酮的研究

趙佳慧，裴晶瑩，李曉磊，劉博，李丹

（長春大學農產品加工吉林省普通高等學校重點實驗室，吉林長春130022）

HPLC法檢測巧克力中微量異黃酮的研究

趙佳慧，裴晶瑩，李曉磊*，劉博，李丹

（長春大學農產品加工吉林省普通高等學校重點實驗室，吉林長春130022）

巧克力由于含有大量脂肪、蛋白質以及碳水化合物等成分，給異黃酮的提取帶來很大干擾，為了能更加準確地檢測巧克力中的微量異黃酮含量，采用研磨粉碎、以甲醇為溶劑超聲波輔助的方法對巧克力中的異黃酮進行提取。然后采用高效液相色譜儀進行定性定量檢測，以C18色譜柱為分離柱，以甲醇/水/甲酸為流動相，在30 min內，以0.8 mL/min的流速梯度洗脫（從20/80/0.1到80/20/0.1）巧克力的甲醇提取物，紫外檢測器的波長設為254 nm。結果表明：巧克力中總異黃酮含量為0.41%。利用這種方法可以準確的檢測巧克力中微量異黃酮含量。

巧克力；異黃酮；高效液相色譜

人們在豆類和谷類等多種植物中發現了大豆異黃酮類物質，而且專家指出，大豆異黃酮與人體雌性激素有著驚人的相似之處。大豆異黃酮在女性保健方面具有顯著的作用，適當的攝入大豆異黃酮，不僅能夠調節人體激素分泌，還可以促進生長因子的活性。現代醫學已經證明：大豆異黃酮可以推遲女性更年期，并且具有延緩女性衰老的作用。研究表明，對于長時間食用豆類食品的人群，其乳腺癌以及前列腺癌的發生率與病死率相對較低，進而表明乳腺癌、前列腺癌等發病率均與大豆的攝取呈負相關性[1]。因此，大豆異黃酮具有抗癌作用。

然而，人們要想通過大豆來攝入異黃酮是有局限性的。主要在于大豆含有大量棉子糖和水蘇糖，容易引起人體腹部飽脹，胃腸不適；一些腎病患者和痛風患者也不宜食用大豆；部分年輕女性因個人喜好較少甚至不食用大豆。

目前，大豆異黃酮的保健食品類型比較單調并且服用不便，主要是以膠囊、片劑的形式存在。在美國召開的第一屆和第二屆國際大豆防治慢性病的會議上，專家一致認為深入研究大豆異黃酮具有重要的理論意義和應用價值[2]。因此，有必要開發含大豆異黃酮的多種食品。

巧克力口感甜美且具有一股濃郁的香氣，體積小便于攜帶，頗受現代年輕女性的青睞。因此在巧克力中加入異黃酮不僅食用起來比較便捷，還可以達到保健作用。由此可見，加入大豆異黃酮的巧克力具有廣闊的市場發揮空間。本論文建立了一種檢測巧克力中微量異黃酮的方法，旨在為這類新型異黃酮食品的生產、質量控制、人體試驗，提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

巧克力樣品：由國家大豆深加工技術研究推廣中心李榮和教授提供。

染料木苷（genistin）、大豆苷（daidzin）、染料木素（genistein）、大豆素（daidzein）標準品：購自美國 Sigma公司；甲醇（色譜純）：購自美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆熱電飛世爾科學有限公司；二次蒸餾水：長春大學農產品加工吉林省普通高等學校重點實驗室自制；其他均為國產分析純試劑。

舒美KQ-300VDE超聲波清洗機：昆山超聲儀器有限公司；濾膜（聚四氟乙烯）：豐源過濾設備有限公司；Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀：島津，日本東京；安捷倫XDB-C18色譜柱：美國安捷倫。

1.2 大豆異黃酮粉溶液的配制

精確稱取大豆異黃酮粉5.0 mg，置25 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解，并定容至刻度，搖勻作為對照溶液。

1.3 巧克力異黃酮的提取

將巧克力用研缽進行研磨。取2.0 g巧克力顆粒，加入100 mL容量瓶，再加入甲醇至刻度線，在超聲波清洗機中以20、45、100 kHz三頻交替提取1 h；待冷卻至室溫后，再補充甲醇定容至刻度線，并混勻。以0.45 μm孔徑的微孔濾膜過濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。

1.4 異黃酮含量的測定

采用高效液相色譜儀測定條件為色譜柱3.5 μm（150 mm×4.6 mm）；流動相，A：甲醇/水/甲酸（20/80/0.1，體積比）；B：甲醇/水/甲酸（80/20/0.1，體積比）；洗脫梯度：0 min，100%A；0～30 min 內，B 由 0 線性增加到100%；UV檢測器，檢測波長254 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：20 μL。采用標準曲線法定量染料木苷、大豆苷、染料木素、大豆素。

2 結果與討論

2.1 巧克力中異黃酮提取方法的選擇

大豆異黃酮的提取方法有很多種，如溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、微波萃取法和超聲波萃取法。溶劑萃取法雖然操作簡單，但有溶劑殘留，產品回收率低，純度低，對試驗結果有一定影響。微波萃取法可縮短萃取時間，提高萃取率，但耗能大成本高，也不適合用于試驗研究。超聲波提取法常作為溶劑萃取法的輔助方法，其原理是空化作用對細胞膜的破壞有助于異黃酮類化合物的釋放與溶出，超聲波使提取液不斷振蕩，有助于溶質擴散[3-4]。高榮海等[5]對溶劑提取法和超聲波輔助提取法從脫脂豆粕中提取大豆異黃酮進行了比較研究，結果表明超聲波輔助提取法的得率和質量分數均略高于乙醇回流提取法的得率和質量分數，而且超聲波輔助提取法具有提取時間短的優點，是提取大豆異黃酮較為理想的方法。綜合考慮，決定選用超聲波提取法進行檢測。

2.2 巧克力中異黃酮提取溶劑的選擇

有機溶劑萃取法是國內外提取大豆異黃酮使用最廣泛的方法，常用的有機溶劑有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷以及它們的水溶液或混合溶液[6-7]。

由于異黃酮在溶劑中的溶解性能相差很大，沒有一種能適合所有異黃酮成分的提取溶劑，所以必須根據目標成分的性質及雜質的類別來選擇溶劑。一般極性溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等適合于提取各種異黃酮苷。最常選用的提取溶劑是乙醇，其毒性小、且與水混和可以得到不同的極性，所以一般使用70%的乙醇進行提取大豆異黃酮[8]。

但因巧克力中異黃酮含量較低，且巧克力中含有碳水化合物、蛋白質和脂肪等成分不易提取分離。因此本研究用甲醇為溶劑萃取，以提高異黃酮的得率。

2.3 巧克力中異黃酮的高效液相色譜定性分析

試驗采用較低成本的水、甲酸和甲醇混和液為流動相，進行梯度洗脫，經過C18色譜柱后，在UV254 nm進行檢測。大豆異黃酮粉甲醇提取物異黃酮高效液相色譜圖如圖1所示，巧克力甲醇提取物異黃酮高效液相色譜圖如圖2所示。

圖1 大豆異黃酮粉甲醇提取物異黃酮高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of isoflavones from soybean isoflavone

由圖1和圖2可以看出，大豆異黃酮粉中的異黃酮和從巧克力中提取的異黃酮的高效液相色譜圖峰值的時間比較相似。

圖2 巧克力甲醇提取物異黃酮高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of the methanol extract of chocolate

采用染料木苷、大豆苷、染料木素、大豆素標準品進行定性分析表明：巧克力甲醇提取物HPLC色譜中保留時間12.615 min的色譜峰為大豆苷，染料木苷的保留時間為24.230 min，保留時間15.340 min的色譜峰為染料苷，大豆素的保留時間為21.662 min。在前12.615 min和24.230 min后有較小的未知峰，在本研究所用的色譜條件下對異黃酮組分的確定和定量分析產生的影響可以忽略。

以上的結果表明：巧克力中染料木苷的含量最多，但與大豆異黃酮粉中的異黃酮含量相比，巧克力中異黃酮的各種成分含量相對偏低。

2.4 巧克力異黃酮的含量

根據大豆苷、大豆素、染料苷和染料木苷的標淮曲線，對巧克力中異黃酮各成分含量進行計算，取平均值得出最終結果，如表1所示。

表1 巧克力中異黃酮含量Table 1 Isoflavone content in chocolate %

由表1可知，巧克力中總異黃酮的平均含量為0.41%。

3 結論與討論

采用高效液相色譜儀進行定性定量檢測，以C18色譜柱為分離柱，以甲醇/水/甲酸為流動相，在30 min內，以0.8 mL/min的流速梯度洗脫（從20/80/0.1到80/20/0.1）巧克力的甲醇提取物，紫外檢測器的波長設為254 nm。結果表明：巧克力中總異黃酮含量為0.41%。利用這種方法可以準確的檢測巧克力中微量異黃酮含量。

對巧克力進行預處理，然后用甲醇超聲波提取異黃酮，再利用高效液相色譜法定性定量，可以準確的分析巧克力中異黃酮的種類和含量。人體每天攝入異黃酮的含量標準是80 mg，一塊巧克力的質量大約是10 g，經計算每天吃兩塊巧克力即可達到異黃酮的攝入標準。

[1] 李玉珍,林親錄,肖懷秋,等.大豆異黃酮的功能特性研究進展[J].中國食物與營養,2005(10):21-22

[2] 謝明杰,高爽,劉長江,等.大豆異黃酮生理功能的研究進展[J].食品與發酵工業,2004,30(5):94-98

[3] 潘廖明,姚開,賈冬英,等.超聲波提取大豆異黃酮[J].中國油脂,2003,28(11):85-87

[4] 謝明杰,宋明,鄒翠霞,等.超聲波提取大豆異黃酮[J].大豆科學,2004,23(1):75-76

[5] 高榮海,趙秀紅,鄭艷,等.大豆異黃酮提取工藝的比較研究[J].糧食加工,2008,33(4):41-44

[6] 李長江,張蔡華.大豆異黃酮提取工藝研究[J].黃山學院學報,2009,8(3):56-58

[7] 王葭.大豆異黃酮的研究進展[J].河北師范大學學報,2002,26(1):74-77

[8]李丹,李曉磊.高效液相色譜法檢測大豆酸乳中微量異黃酮的研究[J].長春大學學報,2008,18(5):61-64

Study on Determination of Trace Isoflavones in Chocolate by HPLC

ZHAO Jia-hui，PEI Jing-ying，LI Xiao-lei*，LIU Bo，LI Dan
（Jilin Key Lab of Agricultural Products Processing in Changchun University，Changchun 130022，Jilin，China）

Fat，protein and carbohydrates in chocolate have a great negatively effect on the extract of isoflavones.In order to more accurately detect the content of trace isoflavones in chocolate，ultrasonic extraction in methanol and HPLC with a C18 column were used.The chromatography was performed at a flow rate of 0.8 mL/min using the mobile phase methanol/water/formic acid from 20/80/0.1 to 80/20/0.1 in 30 min.UV detector wavelength was set to 254 nm.The results showed that the content of total isoflavones in chocolate was 0.41%.This method could be used to detect the trace isoflavones in chocolate.

chocolate；isoflavone；high performance liquid chromatography

2016-09-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.028

國家自然科學基金“青年科學基金項目”（NSFC-31000760）

趙佳慧（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：功能食品和生物技術。

*通信作者：李曉磊，女（漢），副教授，博士，主要從事功能食品和生物技術的研究。