UPLC-MS/MS檢測運動食品中β-受體激動劑殘留

周帥，張飛云

（西安交通大學城市學院，陜西西安710018）

UPLC-MS/MS檢測運動食品中β-受體激動劑殘留

周帥，張飛云

（西安交通大學城市學院，陜西西安710018）

建立一種超高效液相色譜-串聯質譜法檢測運動食品中西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅10種β-受體激動劑殘留的分析方法。樣品前處理用乙腈沉淀蛋白后，采用MCX小柱進行凈化和富集。采用Waters Atalantis T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）分離，以0.1%甲酸-乙腈為流動相的梯度洗脫模式下，β-受體激動劑在1.0 ng/mL～20.0 ng/mL濃度范圍內線性良好，相關系數r2為0.993～0.999，檢出限為 0.5 μg/kg，定量限為 1.5 μg/kg，加標回收率達到 78.2%～91.8%。該方法具有前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高和檢測速度快的優點，適用于運動食品中西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種β-受體激動劑殘留的分離和定量檢測。

超高效液相色譜-串聯質譜；運動食品；β-受體激動劑

β-受體激動劑是一類化學合成的苯乙醇胺類物質，國內養殖戶一般將其添加到動物飼料中去，這樣能夠提高飼養動物的胴體瘦肉率，從而賣出好價錢。但是若人體食用含有過量β-受體激動劑藥物的動物源性食品后，將會引發惡心、嘔吐、激動、失眠、食欲減退等一系列不良反應[1-2]，所以農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定在所有動物源性食品中不得檢出此類藥物[3]。但一些不法商販為獲取經濟利益，仍然非法使用該類藥物，這對購買的消費者是一種潛在的危害。所以以動物源性為材料的運動食品也有可能存在β-受體激動劑藥物殘留的可能，且對此類運動食品中多種β-受體激動劑藥物的殘留研究報道不多，故本試驗對此類動物源性運動食品進行檢測研究。

目前常見的β-受體激動劑藥物有西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等。檢測方法也有很多，主要有酶聯免疫測定法、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-串聯質譜聯用法（liquid chromatography tandem mass spectrometry ，LC-MS/MS）等[4-9]。已有的方法常有靈敏度不高，前處理煩瑣、檢測藥物單一或重現性不好等問題，很難滿足對藥物殘留的同時確證檢測。本試驗所用的方法結合了超高效液相色譜的高分離能力和質譜提供結構信息的功能，具有靈敏度高、選擇性強的優勢。特別是在前處理階段采用固相萃取技術，對于復雜樣品的分析檢測，不僅可以避免基質干擾等問題，而且可以起到一個富集目標物的作用，分析鑒定以往難于辨識的痕量成分。本方法針對10種β-受體激動劑類藥物殘留建立了一種快速簡便、專屬性強、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯質譜方法，在實驗室的推廣可行性較高，可為動物源性運動食品中10種β-受體激動劑類藥物殘留的監督檢驗和殘留監控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司Agilent 1290，四極桿串聯質譜儀：美國AB公司API4000；

西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅10種標準品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈為色譜純：美國Fisher Scientific公司。

1.2 超液相色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相 A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～2.0 min 80%A；2.0～5.5 min 80%A →30%A；5.5～8.0 min 30%A→80%A；8.0 min 80%A。

1.3 方法

1.3.1 質譜條件的優化

采用針泵連續進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對各個目標物進行母離子全掃描，然后對其子離子進行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數進行優化。

1.3.2 標準曲線的制作

稱取相應質量的西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅標準品，配制成濃度為1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng/mL 的標準溶液，進行質譜儀分析，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品前處理條件的優化

動物源性運動食品中含有豐富的蛋白質和脂肪類物質，食品基質復雜，對前處理要求高，本試驗以目標物的加標回收率為比較依據，對幾種常用的提取溶劑以及固相萃取小柱，進行比較，選擇較優的前處理條件。

1.3.4 加標回收試驗及樣品測定

以市售未檢測出β-受體激動劑藥物的運動食品為空白基質，加入標準混合溶液，選擇優化后的前處理條件和儀器條件，上機檢測，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

采用針泵連續進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，分別對濃度為10 ng/mL的西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅的標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，優化各母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎上，對其子離子進行全掃描，選擇兩組豐度最高的離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數進行優化。

優化后的質譜參數為：噴霧電壓5 500 V、離子源溫度500℃、氮氣流量30 L/min、掃描停滯時間100 ms，其他質譜參數見表1。

表1 10種β-受體激動劑的多反應監測掃描模式的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for 10 β-agonist drugs

續表1 10種β-受體激動劑的多反應監測掃描模式的質譜參數Continue table 1 Mass spectrometric parameters for 10 β-agonist drugs

依照表1所設定質譜和超高效液相色譜的條件，選擇多反應監測模式（multiple reaction monitoring mode，MRM）進行檢測，10種β-受體激動劑能在10 min內快速分離，結果如圖1所示。

2.2 標準曲線的制作

為了驗證西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅在優化好的儀器條件中的線性關系，配制了濃度為 1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng/mL 的系列混合標準溶液上機進行檢測。試驗結果表明，10種β-受體激動劑在1.0 ng/mL～20.0 ng/mL內均具有良好的線性關系（r2＞0.99），并得到10種目標組分的LOD均為 0.5 μg/kg，LOQ 均為 1.5 μg/kg，結果見表 2。

2.3提取溶劑的選擇

圖110 種β-受體激動劑的MRM圖Fig.1 MRM chromatogram of 10 β-agonist drugs

在對西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種目標物提取的過程中，目標物易被運動食品中的蛋白質所吸附，所以在前處理過程中既要考慮蛋白質的去除也要避免目標物被蛋白質沉淀所吸附。本試驗參考相關文獻[10-15]，比較了0.2 mol/L乙酸銨溶液、乙酸乙酯、乙醇、乙腈等4種提取溶劑對10種目標物的提取效果，具體結果見圖2。

表2 10種β-受體激動劑的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 10 β-agonist drugs

圖2 提取液對10種β-受體激動劑平均回收率的影響Fig.2 The effect of extract solution on the average recovery rate for 10 β-agonist drugs

結果如圖2所示，4種提取溶劑中，當乙酸銨溶液以及乙酸乙酯作為提取溶劑時，樣品中的蛋白質沉淀不充分，提取液出現渾濁現象；當乙醇和乙腈為提取溶劑時，樣品中的蛋白質沉淀效果明顯，提取液易于分離，其中乙醇提取率不及乙腈，乙腈的提取效果最好，回收率最高，所以本試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 固相萃取柱的選擇

運動食品中的基質成分復雜，特別是以動物源性的運動食品中，即使是經乙腈提取后的提取液中也含有很多雜質干擾目標物在儀器上的響應。所以本試驗采用固相萃取小柱對提取液進行進一步的凈化和富集，并比較了常用的硅膠小柱、中性氧化鋁小柱、MCX小柱、HLB小柱以及C18小柱等5種固相萃取小柱對10種β-受體激動劑的凈化效果，結果以10種目標物的平均加標回收率作為比較依據。

結果發現，相比較其他幾款小柱，MCX小柱對樣品提取液的凈化效果最好，加標回收率最高。主要是因為在酸性條件下，MCX小柱能夠吸附具有一定弱堿性的β-受體激動劑，淋洗液淋洗雜質后，再用堿性有機溶劑進行洗脫，洗脫液較為干凈，雜質少，能對提取液起到很好的凈化效果。

2.5 加標回收與相對偏差

在上述優化后的前處理條件儀器條件下，利用空白基質的樣品進行加標回收率試驗，在分別添加0.5、5.0、20.0 μg/kg等3個濃度梯度的標準混合溶液，每個濃度平行測定5次，測定結果見表3。

表3 方法的回收率及相對標準偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表3可見，10種β-受體激動劑的加標回收率為78.2%～91.8%，相對標準偏差（RSD）為1.9%～3.9%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

2.6 實際樣品的測定

利用本試驗優化后處理方法及檢測方法，對市場上隨機購買的20個批次動物源性運動食品進行測定，結果良好，未發現上述10種β-受體激動劑的殘留。并且利用農業部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法》[16]，對適用于該標準的9種β-受體激動劑進行復檢，結果20個批次動物源性運動食品也未檢測出陽性樣品，表明該方法實際可行，可用于實際樣品的測定。

3 結論

建立一種超高效液相色譜-串聯質譜檢測動物源性運動食品中西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種β-受體激動劑殘留的分析方法。結果表明，通過優化后的質譜條件，在MRM掃描模式下，10種β-受體激動劑組分能在10 min實現快速分離檢測。樣品經過乙腈提取后，提取液再采用MCX小柱可有效去除樣品中的復雜基質，可實現對目標物質的凈化與富集，能準確快速有效地檢測動物源性運動食品中的西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種β-受體激動劑的藥物殘留。

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Analysis β-Agonist Drugs Residues in Sports Food by UPLC-MS/MS

ZHOU Shuai，ZHANG Fei-yun
（Xi'an Jiaotong University City College，Xi'an 710018，Shaanxi，China）

A ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry analysis method was established for the residues determination of cimaterol，terbutaline，salbutamol，fenoterol，rackdopamine，clorprenaline，clenbuterol，tulobuterol，phenylethanolamine A and penbutolol in sports food.After treated with acetonitrile，the sample concentrated and purified by MCX solid phase extraction column.The separation of targeted compound was performed on a Waters Atalantis T3 chromatographic column（2.1 mm×150 mm，3 μm）using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of β-agonist drugs components was in the range of 1.0 ng/mL-20.0 ng/mL with a correlation coefficient of 0.993-0.999.The detection limit was 0.5 μg/kg and the quantitative limit was 1.5 μg/kg.The recovery rate was 78.2%-91.8%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate，and is suitable for the separation and quantitative detection of cimaterol，terbutaline，salbutamol，fenoterol，rackdopamine，clorprenaline，clenbuterol，tulobuterol，phenylethanolamine A and penbutolol in sports food.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；sports food；β-agonist drugs

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.033

周帥（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：運動訓練。