運動飲料中糖分的檢測

劉國廠

（黃河科技學院，河南鄭州450006）

運動飲料中糖分的檢測

劉國廠

（黃河科技學院，河南鄭州450006）

建立一種用高效液相色譜-蒸發光檢測法測定運動飲料中常用的木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等10種糖分的檢測方法。樣品經乙腈-水提取，過濾膜后上機檢測。采用ZORBAX糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水梯度洗脫作為流動相，用蒸發光檢測器檢測，外標法峰面積定量。結果表明，10種糖組分在0.01 g/100 mL～0.50 g/100 mL濃度范圍內線性良好，相關系數r2為0.996～0.999，檢出限為 0.02 mg/mL～0.1 mg/mL，定量限為 0.06 mg/mL～0.3 mg/mL，加標回收率達到 90.2%～98.5%。

高效液相色譜；運動飲料；糖

運動飲料是根據人體運動的生理消耗而配置的，通過合理補充營養代謝物質使運動員抗疲勞能力提高，優化肌肉和肝糖原儲備，維持血糖穩定，促進疲勞的消除，來提高運動能力。運動飲料中主要含有碳水化合物，電解質，維生素，氨基酸等成分，能補充人體所需的營養成分，抗疲勞，平衡新陳代謝[1]。其中碳水化合物就包括糖類物質，它的添加在給飲用人群提供能量的同時，也帶給人們更好的感官享受。在我國標準GB 15266-2009《運動飲料》[2]中，雖然未對運動飲料中的糖分作出限量，但是針對特殊人群的飲料，有必要了解其中的糖含量以及糖的種類，以便更好安排攝入食品種類數量，防止高糖分給帶來身體危害。

本試驗就針對此，測定其中常見的10種糖分即木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標的含量。目前，食品中糖含量的測定有滴定分析法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-7]和離子色譜法[8-9]等，但結合糖類物質自身易溶于水、低揮發性、不易電離等特點，液相色譜法是目前較理想、實用的檢測方法。液相色譜方法中示差折光檢測器依據折射率的變化對樣品進行檢測，極易受溫度、流動相梯度等條件的影響，導致譜圖基線漂移，靈敏度偏低，實際應用并不理想。蒸發光散射檢測器（ELSD）基于樣品顆粒對光的散射與質量呈指數關系進行測定，與被測物質的官能團和光學性質無關[11-13]，且受溫度、梯度洗脫等試驗條件影響小，適合于無紫外吸收或只有紫外末端吸收、低揮發性物質的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1200series高效液相色譜儀：美國Agilent，Alltech 3300蒸發光散射檢測器：美國Agilent。

木糖標準品、果糖標準品、葡萄糖標準品、半乳糖標準品、蔗糖標準品、麥芽糖標準品、乳糖標準品、蔗果三糖標準品、蔗果四糖標準品、蔗果五糖標準品：國家標準物質中心。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機購買市場上銷售的運動飲料。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX NH2糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；

流速：1.2 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 試驗方法

1.4.1 流動相體系對糖分色譜行為的影響

固定流動相流速1.2 mL/min，考察不同的流動相組成以及不同洗脫模式對10種糖的分離效果。

1.4.2 蒸發光散射檢測器的條件優化

蒸發光散射檢測器的兩個較重要的參數分別是漂移管溫度和載氣流速，兩者對組分的保留時間影響較小，但對信噪比（S/N）的影響較大，一般建立適當的高效液相-蒸發光散射檢測器分析方法時，需對這兩個參數進行優化。

1.4.3 標準曲線的制作

稱取相應質量的木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標準品，配制成濃度為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 g/100 mL的標準溶液，進行儀器分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.4 樣品前處理條件的優化

運動飲料中除了固有的一些食品基質外，還含有很多的人為添加的營養元素，成分復雜，對前處理要求高，所以本試驗樣品前處理對3種不同的提取液Ⅰ：甲醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅱ：乙醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅲ：乙腈-水（1∶1，體積比）進行比較，以樣品加標平均回收率為比較依據，制定較優的前處理條件。

1.4.5 加標回收試驗

以市售運動食品為基質，加入10種糖分的混標溶液，選擇優化后的前處理條件操作，上機檢測，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

食品中糖類檢測比較常用的色譜柱有NH2柱、C18柱以及鈣型陽離子柱。因此，本試驗比較了這3種不同的色譜柱，發現NH2糖分析柱更具有優勢，10個目標物質峰基本都能出峰，而C18柱、鈣型陽離子柱這兩種色譜柱分析的譜圖效果不理想。這是由于在這10種糖的混合標準物質的分析中，由于NH2柱的特殊鍵合力，能與不同糖分子形成氫鍵的結合力強弱不同，在分離時更具有優勢。所以本試驗選擇NH2柱進行10種糖的分析色譜柱。

2.2 流動相體系對糖分色譜行為的影響

由于ELSD在霧化過程中需將流動相及樣品溶劑揮發，形成被測樣品微顆粒進行散射光檢測，因此，試驗中一般不使用不易揮發的緩沖鹽（如乙酸銨等）進行色譜行為的調節。試驗考察等度模式洗脫下不同組分及比例的流動相組成Ⅰ：甲醇∶水=60∶40（體積比）；流動相Ⅱ：乙腈∶水=60∶40（體積比）；流動相Ⅲ：乙腈∶水=70∶30（體積比），流動相Ⅳ：乙腈 ∶水=80∶20（體積比），以及梯度洗脫條件下對10種糖分分離效果的影響，結果見圖1。

圖1 混合標準溶液的色譜圖Fig.1 The chromatogram of mixed standard solution

結果表明：等度洗脫的模式下，乙腈與甲醇相比，乙腈的洗脫能力更強，比較適合多組分目標物的洗脫分離；在乙腈-水流動相中，水的比例對容量因子影響顯著，隨水含量的增加，各組分保留時間明顯提前，容量因子逐步減小。其中流動相Ⅳ：乙腈∶水=20∶70（體積比）的分離度最好，但仍有組分不能分開；所以選擇乙腈-水的流動相組成，嘗試在梯度模式的洗脫條件下，通過優化乙腈-水的比例，最終條件為：0～1 min，80%乙腈；1 min～5 min，90%乙腈；5 min～20 min，75%乙腈；20 min～35 min，80%乙腈。此條件下10種組分可以等到可得到良好的基線分離。

2.3 ELSD條件的優化

試驗考察了不同載氣流速（載氣壓力）0.8 L/min，1.0、1.2、1.4、1.6 L/min 和不同漂移管溫度 40、50、60、70℃對檢測響應值的影響。結果表明：載氣流速對響應值的影響比漂移管溫度對響應值的影響明顯。結合試驗中液相色譜的流量，合理的載氣流速可以保證被測樣品微霧滴的有效形成。漂移管溫度的調節更多地體現在對基線噪聲的影響上。當被測樣品以微霧滴形式進入漂移管時，比表面積的大幅增加使溶劑的揮發溫度遠低于通常的沸點，隨著溫度的升高，目標物峰面積的變化趨緩，噪聲增加，信噪比反而下降，結果見圖2。

圖2 不同漂移管溫度和不同載氣流速條件下混合標準溶液的色譜圖Fig.2 The chromatograms of mixed standard solution in different drift tube temperatures and different flow rates of carrier gas

保持漂移管溫度60℃，以0.05 g/100 mL 10種糖分混合標準溶液的信噪比（S/N）考察最佳載氣流速。結果表明：載氣流速過小，霧化不充分，過大則可能導致目標物的損失，信號值降低。載氣流速由0.8 L/min升至1.6 L/min時，各組分的信噪比隨載氣流速呈拋物線變化；當載氣流速為1.2 L/min時，信噪比達到最高，試驗選擇載氣流速為1.2 L/min。保持載氣流速為1.2 L/min，調節不同漂移管溫度，考察0.05 g/100 mL下10種糖分混合標準溶液的峰面積變化情況。結果表明：漂移管溫度在40℃～70℃之間時，峰面積呈下降趨勢，但幅度不明顯，尤其高于60℃后變化更趨平緩，考慮到溫度太低溶劑揮發不完全，基線不穩，試驗選擇漂移管溫度為60℃。綜合以上考慮，經過試驗摸索，確定最佳漂移管溫度為60℃，最佳載氣流速為1.2 L/min。

2.4 標準曲線的制作

為了驗證10種糖分在乙腈-水流動相體系中的線性關系，配制了濃度為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 g/100 mL的系列混合標準溶液。結果表明，10種糖分在0.01 g/100 mL～0.50 g/100 mL內均具有良好的線性關系（R2＞0.99）；采用在空白基質中添加目標組分的方法，依據色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到10種目標組分的LOD和LOQ分別為0.02 mg/mL～0.1 mg/mL和0.06 mg/mL～0.3 mg/mL，結果見表 1。

表1 10種糖分的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of ten kinds sugar

2.5 提取液的選擇

參考相關文獻[10，13]，針對于樣品提取液的選擇，分別選用提取液Ⅰ：甲醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅱ：乙醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅲ：乙腈-水（1∶1，體積比）來進行比較，分別稱取2.0 g試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入提取液定容至刻度，旋渦振蕩2min，用0.45 μm濾膜將樣液過濾入樣品瓶中供液相色譜測定。

試驗結果以10種糖分的平均回收率為比較依據，結果見圖3，乙腈-水（1∶1，體積比）作為提取液效果最好，10種糖分的平均回收率較好。

2.6 樣品的測定及加標回收

在隨機抽取的20個批次的運動飲料中，根據上述試驗結果選擇優化后儀器條件，選擇乙腈-水（1∶1）溶液提取，過濾后上機檢測結果見圖4。

結果表明：在所檢測的運動飲料樣品中，果糖值在13.5 mg/g～24.6 mg/g之間，葡萄糖值在12.3 mg/g～20.5 mg/g之間，半乳糖值在1.6 mg/g～10.8 mg/g之間，蔗糖值在9.4 mg/g～56.5 mg/g之間，麥芽糖值在0.2 mg/g～2.4 mg/g之間，乳糖值在5.8 mg/g～25.9 mg/g之間，木糖，蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖均未檢出。結果見圖4，是兩種運動飲料中糖分的分析色譜圖。加標回收試驗中，在加標濃度為0.50 g/100 mL的飲料樣品中，10種糖分的加標回收率在90.2%～98.5%之間，符合檢測要求。

圖3 提取液選擇對10種糖分平均回收率的影響Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate for the ten kinds sugar

圖4 部分實際樣品分析色譜圖Fig.4 Analysis chromatogram of part real samples

2.7 與國標方法測定值的比較

在本試驗測定的20個批次的運動飲料中，將其中含有蔗糖的兩個樣分別采用GB/T 5009.8-2008《食品中蔗糖的測定》的第二法（酸水解滴定法）和GB/T 22221-2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定高效液相色譜法》（該標準采用高效液相色譜-示差折光法）進行測定比較，見表2。

從表2中可以看出本法測定結果與GB/T 22221-2008結果更為吻合，以mg/g為單位，GB/T 5009.8-2008（第二法）只能精確到整數位，特別是濃度較低時，準確性不如高效液相色譜法。因此本法操作簡單、方便快速、準確性高，可以滿足運動飲料中糖類的成分和含量測定的要求。

表2 本法測定的樣品中蔗糖含量與國標方法測定值的比較Table 2 Comparison of sucrose detection results by this method and national methods

3 結論

本文建立了一種高效液相色譜-蒸發光檢測器檢測運動飲料中木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等10種糖同時分離檢測的方法。結果表明，在乙腈-水流動相體系梯度洗脫條件：0～1 min，80%乙腈；1 min～5 min，90%乙腈；5 min～20 min，75%乙腈；20 min～35 min，80%乙腈，載氣流速為1.2 L/min、漂移管溫度60℃的條件下木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等10種組分能得到良好的基線分離，且在0.01 g/100 mL～0.50 g/100 mL內均具有良好的線性關系，10種目標組分的LOD和LOQ分別為 0.02 mg/mL～0.1 mg/mL 和 0.06 mg/mL～0.3 mg/mL。樣品在經提取液：乙腈-水（1∶1，體積比）的提取下，10種糖分的加標回收率在90.2%～98.5%之間，可實現對目標物的凈化，準確有效地檢測運動飲料中的糖分含量及種類，可為運動人群更好地了解攝入食物的營養成分提供參考。

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Analysis Sugar in Sports Drink

LIU Guo-chang
（Huanghe Science&Technology College，Zhengzhou 450006，Henan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of ten sugars（xylose，fructose，glucose，galactose，sucrose，maltose，lactose，1-kestose，nystose，1F-Fructofuranosyl nystose）in sports drink by high performance liquid chromatography-ELSD detection method.The samples were extracted by acetonitrilewater，and detected on the machine after filtering membrane.The separation of targeted compound was performed on a ZORBAX sugar analysis chromatography column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-water as mobile phase，with ELSD detector and external standard method peak area quantification.The linear range of ten kinds sugar was in the range of 0.01 g/100 mL-0.50 g/100 mL with a correlation coefficient of 0.996-0.999.The detection limit was 0.02 mg/mL-0.1 mg/mL and the quantitative limit was 0.06 mg/mL-0.3 mg/mL.The recovery rate was 90.2%-98.5%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；sugar

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.034

劉國廠（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育教育訓練學。