核桃內(nèi)種皮提取物對小鼠腦損傷的改善作用

張澤生，王霄然，王田心，*，秦程廣，高山，王春龍

（1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津科技大學(xué)，天津300457；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457）

核桃內(nèi)種皮提取物對小鼠腦損傷的改善作用

張澤生1，2，王霄然1，2，王田心1，2，*，秦程廣1，高山1，王春龍1

（1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津科技大學(xué)，天津300457；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457）

研究核桃內(nèi)種皮多酚提取物對D-半乳糖致衰小鼠腦組織氧化損傷程度的調(diào)節(jié)。選取ICR雄性小鼠60只，隨機(jī)分為5組，每組12只，對模型對照組和劑量組小鼠采取頸部皮下注射D-半乳糖[120 mg/（kg·bw·d）]制造衰老模型，低、中、高劑量組分別灌胃200、400、800 mg/（kg·bw·d）的核桃內(nèi)種皮多酚提取物，模型對照組灌胃等量的雙蒸水。給藥7周后，通過曠場試驗、緊繩實驗和平衡木實驗檢測每組小鼠間的行為學(xué)差異。8周后，取腦組織，測定腦組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力和總抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果表明，與模型對照組相比，核桃內(nèi)種皮多酚提取物可顯著提高小鼠的運(yùn)動和探索能力，增強(qiáng)小鼠的興奮性和對環(huán)境的適應(yīng)性。同時，腦組織中SOD、GSH-Px活力和T-AOC含量較模型組有顯著升高。這表明核桃內(nèi)種皮多酚提取物可減輕D-半乳糖導(dǎo)致的行為遲鈍，并能減輕小鼠腦部的氧化損傷。

核桃內(nèi)種皮；多酚；衰老；腦；氧化損傷

目前，自由基導(dǎo)致衰老的理論在相關(guān)研究中占有重要地位，已經(jīng)有大量的實驗證實其致衰作用，D-半乳糖致衰模型也得到了廣泛應(yīng)用和支持[1]。腦組織中富含高濃度不飽和脂肪酸，且氧化代謝非常旺盛，是自由基最易侵襲的靶器官，因此也是最容易發(fā)生衰老的組織之一[2]。本試驗以核桃產(chǎn)業(yè)加工過程中產(chǎn)生的廢棄物——核桃內(nèi)種皮為原料，從中提取活性物質(zhì)，對其進(jìn)行活性探究。通過曠場試驗、緊繩實驗和平衡木實驗等行為學(xué)指標(biāo)，以及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力和總抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）的含量，研究核桃內(nèi)種皮多酚提取物對衰老小鼠腦組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 核桃內(nèi)種皮中多酚的提取

經(jīng)堿處理后的核桃內(nèi)種皮廢棄物來自于河北養(yǎng)元飲品有限公司，脫蛋白脫脂后干燥，采用酸性醇溶液加熱提取、濃縮、冷凍干燥得核桃內(nèi)種皮多酚粗提物（純度為12.55%）。用雙蒸水復(fù)溶內(nèi)種皮多酚提取物干粉，配制成適宜濃度的溶液，4℃保存待用。

1.1.2 主要試劑

D-半乳糖：北京索萊寶生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒：南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

MODULYOD-230冷凍干燥機(jī)：Thermo Fisher科技公司；TDL-5-A低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JD1000-2電子天平：龍騰電子有限公司；BS224S分析天平：賽多利斯貿(mào)易有限公司；Z5高速離心機(jī)：SIGMA有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計：島津檢測技術(shù)有限公司；QL-901微型漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；HH.SY11電熱恒溫水浴鍋：中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.1.4 實驗動物

SPF級6周齡雄性ICR小鼠60只，體重（22±2）g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）提供，合格證號為SCXK（津）2009-0002。飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)清潔級動物實驗房（環(huán)境溫度為：20℃～22℃、環(huán)境設(shè)施合格證號：SCXK（京）2012-0001）。

1.2 方法

1.2.1動物分組及給藥方式

小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，按體重呈S型隨機(jī)分為5組：正常對照組（NC）、D-半乳糖模型對照組（DC）、內(nèi)種皮多酚提取物低（WPL）、中（WPM）、高（WPH）劑量組，每組12只。

每日同一時間采用頸部皮下注射法對DC組和劑量組小鼠注射D-半乳糖滅菌生理鹽水溶液進(jìn)行衰老模型制造，同時采用不同劑量的內(nèi)種皮多酚提取物對劑量組小鼠進(jìn)行灌胃治療，具體給藥方式如下，每日一次，連續(xù)8周。

正常對照組（NC）：皮下注射生理鹽水+雙蒸水灌胃

D-半乳糖模型對照組（DC）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+雙蒸水灌胃

低劑量組（WPL）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+內(nèi)種皮多酚提取物（200 mg/kg）灌胃

中劑量組（WPM）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+內(nèi)種皮多酚提取物（400 mg/kg）灌胃

高劑量組（WPH）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+內(nèi)種皮多酚提取物（800 mg/kg）灌胃

1.2.2 行為學(xué)試驗

1.2.2.1 曠場試驗

曠場試驗用于測定小鼠的自發(fā)探索能力和焦慮性。按照文獻(xiàn)[3-4]設(shè)計一個曠場實驗設(shè)備，采用一開口紙箱（內(nèi)部尺寸為81 cm×81 cm），箱壁直立，高30 cm，底部涂黑，將底部劃分成16個等大方格，并標(biāo)出與方格等大的中間區(qū)域。將小鼠面壁隨機(jī)放入4個邊角中的一個方格內(nèi)，3min內(nèi)讓其自由探索，記錄3min內(nèi)小鼠的跨越方格總數(shù)、跨越中間區(qū)域格數(shù)、理毛次數(shù)、站立次數(shù)以及排便顆粒數(shù)。

1.2.2.2.緊繩實驗

取一根長100 cm，直徑為2 mm細(xì)繩，每隔5 cm標(biāo)記為一格。將繩子繃緊固定于一圓形水池上，并使繩子中點(diǎn)位于圓形水池圓心處，繩子中心距離水面30 cm，水池中水深10 cm，保持水溫25℃。先將小鼠提尾浸入圓形水池中5 s，后將小鼠提尾至于繩子上方，緩慢降低至其前爪牢固抓住繩子，放手并計時。以60 s為界記錄其掉入水中前的懸掛時間（最大60 s）和跨越格數(shù)，每只小鼠連續(xù)測試3次，取平均值[5]。

1.2.2.3 平衡木實驗

取一根長100 cm，直徑10 mm的矩形桿，每隔5 cm標(biāo)記為一格。將桿水平放置于一圓形水池上，并使桿中點(diǎn)位于圓形水池圓心處，兩桿距離水面30 cm，水池中水深10 cm，保持水溫25℃。釋放方法同緊繩實驗，記錄60 s內(nèi)小鼠在桿上的平衡時間和跨越格數(shù)，如小鼠逃至第二平臺則平衡時間視為60 s。每只小鼠連續(xù)測試3次，取平均值。

1.2.3 腦組織抗氧化指標(biāo)的測定

給藥8周后，小鼠于末次給藥后禁食12 h，于處死前稱重并記錄。小鼠眼球取血、頸椎脫臼處死，快速分離腦組織，準(zhǔn)確稱取 0.1 g，按重量（g）：體積（mL）=1∶9的比例加生理鹽水，冰浴條件下機(jī)械勻漿，5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用生理鹽水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，于-80℃保存。按說明書方法測定SOD、CAT、GSHPx活力，T-AOC和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0分析軟件處理，以Mean±SD表示，組間采用t檢驗，其中P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 曠場試驗

曠場試驗相關(guān)數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖1 曠場試驗（M±SD，n=10）Fig.1 Open-field test（M±SD，n=10）

平均跨越格數(shù)可以直接體現(xiàn)小鼠的興奮性和運(yùn)動的靈敏性。從圖1（A）可以看出：模型組小鼠的平均穿越格數(shù)較正常組小鼠有極顯著的減少（P＜0.01），表明模型組小鼠的興奮性和靈敏性明顯降低。與模型對照組相比，核桃內(nèi)種皮多酚提取物劑量組平均跨越格數(shù)有所增加，其中高劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），表明核桃內(nèi)種皮多酚提取物具有提高衰老小鼠興奮性和靈敏性的作用。

平均跨越中間格數(shù)能夠反映小鼠的認(rèn)知和探索能力。正常情況下動物會避開空曠的區(qū)域，在中央格的停留時間短，沿周邊運(yùn)動，對新環(huán)境認(rèn)知能力差的動物，則在中間停留時間較長[6]。從圖1（B）可以看出：模型小鼠較正常小鼠的跨越中間區(qū)域次數(shù)極顯著增加（P＜0.01），表明小鼠的認(rèn)知和探索能力有一定降低。與模型對照組相比，核桃內(nèi)種皮多酚提取物劑量組平均跨越中間格數(shù)有所減少，其中高劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01），表明核桃內(nèi)種皮多酚提取物可以提高D-半乳糖致衰老小鼠在陌生環(huán)境中的空間認(rèn)知和探索能力。

平均理毛次數(shù)能夠反映小鼠對新環(huán)境的滿意程度。動物的理毛行為出現(xiàn)在比較舒適的環(huán)境中，是在新異環(huán)境中的休閑行為，說明小鼠在陌生的環(huán)境較為適應(yīng)。如圖1（C）所示：與正常對照組相比，模型組小鼠理毛次數(shù)極顯著性下降（P＜0.01），表明小鼠對新環(huán)境的滿意程度下降。與模型對照組相比，核桃內(nèi)種皮多酚提取物劑量組小鼠理毛次數(shù)增多，其中核桃內(nèi)種皮多酚提取物高劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），說明表明核桃內(nèi)種皮多酚提取物有助于穩(wěn)定D-半乳糖致衰老小鼠的情緒。

平均站立次數(shù)能夠反映小鼠在陌生環(huán)境中的興奮性和對新異環(huán)境的探究性。如圖1（D）所示：與正常組小鼠相比，模型組小鼠站立次數(shù)極顯著性下降（P＜0.01），與模型對照組相比，興奮性有所下降。核桃內(nèi)種皮多酚提取物劑量組站立次數(shù)有增多趨勢，其中高劑量組有極顯著性差異（P＜0.01），表明核桃內(nèi)種皮多酚提取物有助于提高小鼠在陌生環(huán)境中的興奮性和對新異環(huán)境的探究性。

排便粒數(shù)能夠反映小鼠在陌生環(huán)境中緊張反射情況，排便數(shù)越多表明小鼠在陌生環(huán)境中越緊張。如圖1（E）所示：由于個體差異較大，實驗結(jié)果誤差較大，與空白對照組相比，模型小鼠排便粒數(shù)有增多的跡象。與模型對照組相比，核桃內(nèi)種皮多酚提取劑量組排便數(shù)有降低的趨勢，但均不具有顯著性。

通過這些項目的考察，可以充分的探究小鼠探索性、興奮性、運(yùn)動性等一系列運(yùn)動的水平，從而考核桃內(nèi)種皮多酚提取對D-半乳糖致衰老小鼠的影響。實驗結(jié)果證明，核桃內(nèi)種皮多酚提取可以增強(qiáng)小鼠的探索性、運(yùn)動性、興奮性活動，提高對新環(huán)境反應(yīng)靈敏性和適應(yīng)能力，同時能夠促進(jìn)探索運(yùn)動與自發(fā)活動能力。可以推斷核桃內(nèi)種皮多酚提取可對實驗動物的神經(jīng)行為產(chǎn)生影響，提高其心理運(yùn)動的穩(wěn)定性以及敏捷度，來對大腦的思維活動產(chǎn)生積極影響。

2.2 緊繩實驗

緊繩實驗相關(guān)數(shù)據(jù)如圖2所示。

圖2 緊繩實驗（M±SD，n=10）Fig.2Tightrope test（M±SD，n=10）

緊繩實驗中的平均跨越格數(shù)和懸掛時間能夠反應(yīng)小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性和耐力。從圖2（A）、（B）可以看出，與正常對照組相比，模型對照組這兩項指標(biāo)都有顯著降低（平均跨越格數(shù)：P＜0.01，懸掛時間：P＜0.05），說明模型對照組小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性和耐力受到了一定損害。與模型對照組相比，內(nèi)種皮多酚提取物劑量組能夠增加平均跨越格數(shù)并延長懸掛時間，其中，中、高劑量的內(nèi)種皮多酚提取物可以極顯著增加小鼠的平均跨越格數(shù)（P＜0.01），高劑量的內(nèi)種皮多酚提取物可以顯著延長小鼠的懸掛時間（P＜0.05）。由于緊繩實驗需要運(yùn)動協(xié)同性、較強(qiáng)的肌力和維持平衡的能力，而模型對照組小鼠的兩項指標(biāo)均顯著低于空白對照組小鼠，說明模型對照組小鼠的耐力和運(yùn)動協(xié)調(diào)性受到損害，內(nèi)種皮多酚提取物可以緩解該癥狀，提高小鼠的運(yùn)動能力。

2.3 平衡木實驗

平衡木實驗相關(guān)數(shù)據(jù)如圖3所示。

平衡木實驗中的平均跨越格數(shù)和懸掛時間能夠反應(yīng)小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性和平衡能力。從圖3（A）、（B）可以看出，與正常對照組相比，模型對照組的平均跨越格數(shù)極顯著減少（P＜0.01），說明模型對照組小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性受到了一定損害。與模型對照組相比，內(nèi)種皮多酚提取物劑量組能夠增加平均跨越格數(shù)并延長懸掛時。其中，中、高劑量的內(nèi)種皮多酚提取物可以極顯著增加小鼠的平均跨越格數(shù)（P＜0.01）。在判斷平衡力實驗中，除了模型組和低中劑量組有個別落水，其余均在桿60 s，可能高劑量可以提高衰老小鼠的平衡能力，但數(shù)據(jù)不具有顯著性。由于平衡木實驗需要運(yùn)動協(xié)同性、膽量和維持平衡的能力，而模型對照組小鼠的前項指標(biāo)顯著低于空白對照組小鼠，說明模型對照組小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)性受到損害，內(nèi)種皮多酚提取物可以緩解該癥狀，提高小鼠的運(yùn)動能力。

2.4 腦組織抗氧化指標(biāo)

腦組織抗氧化指標(biāo)相關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示。

由表1可知，模型組小鼠與正常對照組相比，SOD、GSH-Px酶活力及T-AOC含量均有極顯著的降低（P＜0.01），MDA含量略有升高、CAT酶活力略有降低，但都不具有顯著性。各劑量組與模型組相比，SOD、T-AOC、GSH-Px活力均有不同程度的提高，其中，中、高劑量組SOD活力極顯著升高（P＜0.01）；中劑量組（P＜0.05）和高劑量（P＜0.01）組 T-AOC 活力顯著提高；低劑量組（P＜0.05）和中、高劑量（P＜0.01）組 GSH-Px活力顯著提高。與模型組相比，各劑量組MDA含量均有所降低，其中以中劑量組最為明顯，但不具有顯著性；高劑量組CAT酶活力有一定程度的增加，但不具有顯著性。以上實驗結(jié)果表明，核桃內(nèi)種皮多酚提取物可在一定程度上抑制腦組織氧化損傷，起到延緩衰老的作用，中、高劑量組效果較明顯。

圖3 平衡木實驗（M±SD，n=10）Fig.3 Balancing beam test（M±SD，n=10）

表1 內(nèi)種皮多酚提取物對D-半乳糖致衰小鼠腦抗氧化指標(biāo)的影響（M±SD，n=10）Table 1 Effect of walnut pellicle phenolic extracts on brain antioxidant indexes of mice induced by D-galactose（M±SD，n=10）

3 討論

由行為學(xué)實驗結(jié)果可以看出，核桃內(nèi)種皮多酚提取物能夠明顯提升小鼠的運(yùn)動和認(rèn)知能力，增強(qiáng)小鼠的興奮性和對環(huán)境的適應(yīng)性。

由腦組織的生化指標(biāo)可以看出，核桃內(nèi)種皮多酚提取物通過提高腦組織中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化氫酶活力和總抗氧化能力，延緩了D-半乳糖致衰小鼠的衰老進(jìn)程。

綜上所述，核桃內(nèi)種皮多酚提取物具有提高小鼠運(yùn)動能力，增強(qiáng)小鼠興奮性、適應(yīng)性以及抗衰老作用，有一定的腦損傷保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與清除體內(nèi)自由基和增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活力有關(guān)。本實驗可為深入探討其抗衰老機(jī)理提供實驗依據(jù)，同時也為進(jìn)一步開發(fā)和利用核桃內(nèi)種皮廢棄物提供理論基礎(chǔ)。

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Protective Effect of Walnut Pellicle Extracts on Cerebral Injury in Mice

ZHANG Ze-sheng1，2，WANG Xiao-ran1，2，WANG Tian-xin1，2，*，QIN Cheng-guang1，GAO Shan1，WANG Chun-long1
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Institute for New Rural Development，Tianjin 300457，China）

To observe the effects of phenolic extracts from walnut（Juglans regia L.）kernel pellicle（EWP）byproduct on cerebral injury aging mice induced by D-galactose.Male ICR mice（n=60）were randomly divided into five groups of 12 each.Hypodermic injection of D-gal at the dose of 120 mg/（kg·bw·d），low，middle and high groups gived EWP by 200，400，800 mg/（kg·bw·d）respectively，while the control group gavage equivalent normal saline.After 7 weeks，the behavior changes were investigated by open-field test，tightrope test and balancing beam test between dosage groups and normal controls.After 8 weeks，the contents of malonialdehyde（MDA），the activities of superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT），glutathione peroxidase （GSH-Px）and total antioxidant capacity（T-AOC）in brain were observed.The result showed that EWP could significantly improve the mice's ability to exercise and explore，enhance the excitability and the adaptability to the environment.At the same time，it significantly increased activities of the antioxidant enzymes by enhanced activities of SOD，GSH-Px，T-AOC as compared to model group.This indicated that EWP could reduce the action retardation induced by D-galactose，and could reduce the oxidative damage in the brain of mice.

walnut kernel pellicle；phenolic compounds；ageing；brain；oxidative damage

2016-09-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.042

天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院開放基金資助項目（XNC201511）；教育部科技發(fā)展中心“藍(lán)火計劃”產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新項目衡水專項2014年度項目(2014-LHJH-HSZX-017）

張澤生（1956—），男（漢），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。

*通信作者：王田心（1985—），男（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。