大黃主要蒽醌類成分的閃式提取及HPLC檢測

李智平，劉發生，田青平，韓利文，劉可春，張愛平

1.山西醫科大學藥學院，山西太原 030001；2.山東科學院生物研究所（山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室），山東濟南250014

大黃主要蒽醌類成分的閃式提取及HPLC檢測

李智平1,2，劉發生1,2，田青平1，韓利文2，劉可春2，張愛平1

1.山西醫科大學藥學院，山西太原 030001；2.山東科學院生物研究所（山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室），山東濟南250014

目的建立簡便的閃式提取法提取中藥大黃中蒽醌類成分，并用HPLC法測定其中5種主要游離蒽醌的含量，為大黃蒽醌類化合物高效提取和工業生產提供依據。方法建立閃式提取法提取大黃中蒽醌類成分，與常規的回流提取法進行比較研究，采用C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸為流動相，梯度洗脫，建立HPLC檢測方法，同時檢測五種蒽醌的含量，并比較兩種方法的提取效率。結果建立的HPLC法能夠同時檢測5種蒽醌成分，方法準確、可靠。與回流提取方法比較，閃式提取法在短時間內可以達到相近的提取率，顯示了閃式提取大黃蒽醌類化合物的優勢。結論在相同實驗條件下，閃式提取法顯示了快速簡便、節能高效的特點，可為大黃蒽醌類有效成分成分的高效提取和工業生產提供理論依據。

大黃；蒽醌；閃式提取；HPLC；回流提取

大黃有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經及利濕退黃的功效[1]。大黃中提取分離得到的最主要的活性成分是蒽醌及其苷類等[2]。大黃的提取方法文獻已經有很多報道，各種方法對大黃中蒽醌類成分的提取率都有不同的影響。傳統煎煮法提取由于受熱時間過長，大黃蒽醌成分的提取率會降低，同時受熱會破壞物質的結構，從而使其活性減弱[3]。熱回流法提法一般需要多次回流[4]，工藝過程相對復雜，提取還需用到有毒害危險的化學試劑，如氯仿，乙醚等，限制了其在提取生產中的實際應用。超聲法提取大黃粉末的粒度要求高[5]，也存在耗時長的問題。閃式提取是一種新型的提取技術，在短時間內即可實現對目標成分的快速提取[6]。該實驗建立了閃式提取法對大黃蒽醌類成分進行提取，并與回流提取進行比較研究，為大黃蒽醌類成分的高效提取和工業生產提供理論指導依據。

1 儀器和試藥

主要設備：閃式提取器（河南金鼐科技發展有限公司）。旋轉蒸發儀（日本東京理化），真空干燥箱（上海博訊實業有限公司），高效液相色譜儀(日本日立公司)。

對照品：大黃素，大黃酚，大黃酸，蘆薈大黃素和大黃素甲醚購于中國藥品生物制品檢定所，純度均＞98%。一般試劑：磷酸，乙醇、甲醇為市售分析純。大黃藥材購于濟南市建聯中藥店，由山東省科學院生物研究所劉可春研究員鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬C18色譜柱，以乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～10 min，52%A；10～25 min，52%～82%A；25～30 min，82%～90%A；30～35 min，90%A)，流速：1mL/min，室溫，進樣量：10μL，檢測波長：254 nm。 此條件下，樣品中的目標物質都得到充分的分離。

2.2 大黃粉末的提取

閃式提取：干燥的大黃藥材粉碎，過4號篩，稱取粉末5.0 g，準確稱量，加入70%乙醇500 mL，放置在閃式提取儀上室溫提取1 min，提取功率為120 W，提取完畢后，平行進行3次，減壓過濾，濃縮干燥即得大黃提取物。

回流提取：取4號篩大黃藥材粉碎，精密稱取粉末5.0 g 3份，加入70%乙醇500 mL，置于回流裝置上85℃回流60 min，提取完畢后，減壓過濾，濃縮干燥，即得大黃提取物干燥物。

2.3 樣品溶液制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取2 mg左右五種對照標準品，加入甲醇溶解并定容到10 mL的容量瓶，分別配成對照品儲備母液，0.22 μm微孔過濾后儲存于4℃的冰箱中，備用。

2.3.2 供試溶液的制備 分別取的兩種提取方法得到大黃干燥提取物100 mg左右，精確稱量，用甲醇溶解，置于25 mL容量瓶中定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，即得兩種樣品供試溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取“2.3.1”制得混合對照品溶液，按照“2.1”的條件，連續進樣5針。分別測定得到各單體的峰面積，計算各成分5次的RSD。結果顯示，5種成分峰面積的精密度RSD分別為1.0%、0.3%、0.8%、1.3%、1.4%。

2.4.2 線性關系和線性范圍考察 將對照標準品混合儲備液用甲醇分別配制成個不同濃度梯度，再調整進樣量。依次得到五種單體的不同進樣含量峰面積，根據各成分含量與峰面積的關系，得到蘆薈大黃素（y=113.51x+8264），大黃酸（y=120.86x+25 111），大黃素（y=121.58x+158 76），大黃酚（y=177.2x+18995）和大黃素甲醚（y=19.601x+1 181.7）的線性回歸方程，回歸系數R都大于0.999，線性范圍在100～1 000 ng之間。

2.4.3 重復性實驗 稱取大黃閃式得到的干燥提取物5份，按照“2.3.2”項下方法分別制備成樣品供試品溶液，依次進樣檢測，依次得到五種單體成分的峰面積，計算每種成分的RSD。結果顯示，5種成分RSD%分別為1.5%、2.3%、2.0%、2.1%、2.3%。

2.4.4 加樣回收率實驗 取6份干燥提取樣品適量，分別精密加入對照品貯備液，設置低、高2個不同濃度，甲醇定容，再0.22 μm微孔濾膜過濾得到供試溶液，同時在上述色譜條件下測定，計算供試樣中五種蒽醌類化合物的回收率以及RSD值。五種單體的平均回收率(n=6)的結果分別為 102.1%、98.4%、101.9%、102.0%、98.7%，RSD 分別為1.8%、2.0%、1.7%、1.8%、2.2%。

2.5 大黃閃式提取樣品的測定

取“2.2”項下兩種方法制備得到的各3份提取物，按照“2.3.2”項下方法制備供試溶液。兩種方法得到的供試溶液依次“2.1”色譜條件進行實驗檢測。在上述色譜條件下測定5種成分的峰面積，結果顯示，五種物質都在線性回歸方程的應用范圍內，可以代入線性回歸方程，并計算3次檢測含量，得到3次的均值。結果見表1。

表1 不同提取方法中5種蒽醌成分含量比較（n=3）

3 討論

閃式提取法是一種新型的提取方法，其依靠機械剪切力快速破碎，劇烈攪拌，超速動態分子滲濾作用，強力振動作用，從而加速物質溶出[6]。在室溫及溶劑存在下數秒鐘內能夠將藥材的組織粉末物料進一步破碎至細微顆粒，并使有效成分迅速溶于溶劑中，提取時間一般在幾分鐘內即可完成，比傳統提取方法快速、簡便、完全、高效，且具有溶劑用量小特點，適用于工業化生產[7]。

該實驗建立了用于同時檢測大黃提取物中5種蒽醌含量的HPLC方法，對游離蒽醌分離效果好，其他成分對檢測不造成干擾。HPLC檢測方法學通過精密度、穩定性、重復性、回收率驗證結果顯示，HPLC法對蒽醌類成分含量檢測的適用性良好，可用于檢測大黃蒽醌類物質的含量。

該實驗考察了閃式提取法和常規的回流提取法對大黃中5種蒽醌類成分的提取率的差別。回流提取法是參考中國藥典2015版中對大黃蒽醌類提取方法，該法得到大黃蒽醌類提取率相對可靠。結果顯示，閃式提取在1 min左右的提取效率基本與回流提取用60 min提取效率相當，同時具有節能的優點，顯示了明顯優勢，適合于工業生產。所以，在該實驗條件下，閃式提取在提取大黃蒽醌類成分方面顯示了一定的優勢，適合放大生產，這些結果為大黃蒽醌類有效成分成分的高效提取和工業生產提供理論依據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:23.

[2]徐翔,酈柏平,張慧芬．大黃的研究進展[J].上海中醫藥雜志,2003,37(4):56-59.

[3]蘇子仁,周華,劉中秋.大黃在提取精制工藝中的化學變化研究[J].藥物分析雜志,1998,18(2):83-84.

[4]程磊,楊駿,郭靜.大黃蒽醌提取工藝研究[J].上海中醫藥雜志,2012,46(2):71-73.

[5]金波,李薇,蔡偉.大黃總蒽醌提取與純化工藝的研究[J].時珍國醫國藥,2005,16(8):756-757.

[6]武新安,魏玉輝,沈明謙,等.大黃粉末中蔥醒類成分提取方法比較[J].蘭州大學學報，2006,32(4):38-40.

[7]劉翠哲,劉喜綱,王汝興.大黃中總蒽醌的提取工藝研究進展[J].2004,16(4):40-42.

[6]劉延澤.植物組織破碎提取法及閃式提取器的創制與實踐[J].中國天然藥物,2007,5(6):401-407.

[7]李霞,李巍,張化,等.HPLC測定3種甘草廢渣中光甘草定的含量[J].中國現代中藥,2011,6(13):24-26.

Flash Extraction and HPLC Test of Anthraquinones Component of Rhubarb

LI Zhi-ping1,2,LIU Fa-sheng1,2,TIAN Qing-ping1,HAN Li-wen2,LIU Ke-chun2,ZHANG Ai-ping1
1.College of Pharmacy of Shanxi Medical College,Taiyuan,Shanxi Province,030001 China;2.Biological Research Institute of Shandong Academy of Sciences&Key Laboratory of Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences,Jinan,Shandong Province,250014 China

ObjectiveTo establish a simple flash extraction to extract the anthraquinones component of rhubarb and the content of 5 kinds of main free anthraquinones was measured by the HPLC method thus providing basis for the effective extraction and industrial production of anthraquinones component of rhubarb.MethodsThe anthraquinones component of rhubarb was extracted by the flash extraction,and compared with the routine reflux extraction,and the C18 chromatographic column was used and the acetonitrile-0.1%phosphoric acid was used as the mobile phase and the content of five kinds of anthraquinones was tested by the HPLC test method and the extraction effect was compared.ResultsFive kinds of anthraquinones could be tested by the HPLC,and the method was accurate and reliable,and the flash extraction could reach the similar extraction rate in a short time,which showed that the advantages of it in extraction of rhubarb anthraquinone analogues.ConclusionThe flash extraction is rapid,simple,energy-saving and effective under the same experimental conditions,which can provide theoretical basis for the effective extraction and industrial production of anthraquinones component of rhubarb.

Dahuang;Anthraquinone;Flash extraction;HPLC;Reflux extraction

R2

A

1672-5654（2017）06（a）-0121-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.16.121

2017-03-01）

山東省自主創新及成果轉化專項（2014ZZCX02105），山東省重點研發計劃項目（2016GSF121009）。

劉智平（1989-）,男，湖南邵陽人，碩士，研究方向：藥劑學。