菲牛蛭的含量測定方法改進及檢測中的注意事項
2017-07-20 11:21:51張利
云南中醫中藥雜志 2017年3期
張利
摘要：改進菲牛蛭的水蛭素含量測定方法及總結檢測中的注意事項，提高方法的重復性及準確度，更有效地控制菲牛蛭的質量。
關鍵詞：菲牛蛭；水蛭素；含量測定
中圖分類號：R284 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）03—0071-03
菲牛蛭為醫蛭科動物（Poecilobdella manillensis），俗稱金邊螞蟥，別名馬尼擬醫蛭，是吸血類水蛭中個體較大的品種。其抗凝活性成分主要為水蛭素，其抗凝活性、抗血栓作用明顯高于非吸血類水蛭，在治療人類的心血管疾病，尤其是血栓性疾病具巨大的優越性，中國藥典2015年版收載的藥用品種為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra，Whitman、水蛭Hi-nude nipponica，Whitman或柳葉螞蟥Whitmania acran ulata，Whitman的干燥體，與菲牛蛭動物品種來源不完全一致。云南省于2013年將菲牛蛭收錄到《云南省中藥材標準》中。考慮到簡單易行，中國藥典2015版水蛭質量標準及云南省的菲牛蛭質量標準對其水蛭素的含量測定均參照1970年Markwardt報道的凝血酶滴定法制定，其原理是根據水蛭素與凝血酶結合比例為1：1，而凝血酶已有國際單位NIH，水蛭素的活性以抗凝血酶活力單位ATU表示，一個ATU等于中和一個NIH凝血酶的水蛭素量，但此法受試劑及人為因素影響較大，重復性及準確度不夠理想，有報道通過配制不同濃度梯度的凝血酶溶液，多次換試管重滴的濃度梯度法，重復性及準確度較好，但操作繁瑣，耗時，不易掌握。筆者對菲牛蛭水蛭素含量方法進行一定的改進并提示檢測過程中應注意的事項，以提高檢測的重復性及準確度。
1儀器與試藥
超級恒溫水浴槽（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；DELTA320酸度計（梅特勒一托利多公司）；菲牛蛭（批號150601、150607、150706），云南海瑞迪生物藥業有限公司；牛纖維蛋白原（批號140626-201310），牛凝血酶（批號140625-201009），中國食品藥品檢定研究院；水為純化水；其他試劑為分析純。
2方法與結果
2.1原方法測定水蛭素含量
2.1.1供試液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液15 mL，充分攪拌，浸提30 min，并時時振搖，過濾，取續濾液為供試品溶液。2.1.2緩沖液的配制取0.2 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL與0.1 mol·L-1鹽酸溶液約40 mL，加水至100 mL，調節pH值至7.4。
2.1.3凝血酶滴定液的配制 取凝血酶標準品適量，加生理鹽水制成每1 mL含凝血酶40個單位的溶液（臨用配制）。
2.1.4含量測定 精密量取續濾液100μL，置試管（8 mm×38 mm）中，加入含0.5%（牛）纖維蛋白原（以凝固物計）的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（臨用配制）200μL。搖勻，置水浴中（37±0.5）℃保溫5 min，滴加每1 mL中含40單位的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次2μL，邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗的體積，按下式計算。
U=C1V1/C2V2
式中u為每1 g含凝血酶活性單位（U·g-1）；C2為凝血酶溶液的濃度（U·mL-1）；C2為供試品溶液的濃度（g·mL-1）；V1為消耗凝血酶溶液的體積（μL）；V2為供試品溶液的加入量（μL）
中和一個單位的凝血酶的量，為一個抗凝血酶活性單位，本品每1 g含抗凝血酶活性應不低于60U。
2.2含量測定方法改進
2.2.1滴定終點的確定 滴定過程中以觀察到試管內出現凝固物為滴定終點，故受外界及人為因素影響較大。而原方法固定為每分鐘滴加2μL凝血酶溶液，活性規定為不低于60 U·g-1，根據活性的計算公式1μL即可有約12 u·g-1的差異。在測定中發現有時臨近終點有時只需再滴加1μL就發生凝固。另外觀察到滴定過程時間過長、搖動過頻（超過15 min），不易觀察到凝固，10 min內結束滴定方法的重復性較好。改進滴定過程為：先滴加凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次5μL～2μL邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗的體積；新取試管1只，重新測定（根據初測時消耗的體積，調整每分鐘凝血酶的加入量，每次5μL-2μL），但在至近凝固時，改成每1 min滴加1次，每次1μL，滴定過程應在10 min內完成，記錄凝固時消耗凝血酶溶液的體積，以后一次消耗的凝血酶體積計算含量。
2.2.2提取方式考察 同一批樣品分別采用超聲15 min、30 min，振搖30 min、60 min 4種提取方式，結果提取結果一致，為方便易行采用振搖30 min提取。采用0.9%生理鹽水為提取溶劑，分別在室溫（約20℃）、37℃、50℃、70℃下30 min振搖提取，結果顯示，50℃、70℃下溫度下水蛭素的活性明顯下降。其他條件活性結果一致。故可保留原標準提取方式。
2.2.3滴定溫度 溫度對滴定過程影響大，同一批樣品分別在25℃、37℃、50℃、70℃滴定，在25℃、37℃溫度下滴定結果基本一致，后50℃、70℃溫度下活性下降了30%以上，故原標準滴定溫度可行。
2.2.4供試液pH對含量測定結果的影響 配制同批供試液10份，并用1.0 mol·L-1NaOH或1.0 mol·L-1HCL分別調節pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5按
2.2.1項的滴定方法進行含量測定，結果表明供試液pH值4.5～7.0間，其抗凝活性基本穩定（見表1），供試液pH值低于4.0時，溶液不澄清，無法觀察凝固現象，pH值太高則抗凝活性降低。用生理鹽水溶解后的供試品溶液pH值均在4.5-7.0之間。故供試液測定時無需調節pH值。
2.3結果 取3批樣品，按菲牛蛭質量標準與改進后方法分別進行活性測定。3批結果見表2。
3討論
改進每分鐘滴入固定量的凝血酶溶液的原活性測定方法，而根據初測預估消耗凝血酶溶液的體積，再換管重測，臨近終點時降低凝血酶溶液的滴入量，并限定滴定時間，可提高方法的重復性及準確度。
纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液霉變會影響凝固物觀察，故都應臨用新配。樣品溶液、纖維蛋白原及凝血酶溶液均應澄清，否則會造成滴定終點提前。
每次的應輕微搖動，否則易造成原來凝固物分散。觀察是否出現凝固時不應將試管拿出水面，整個滴定過程都應在37℃水浴中進行。
水蛭素的活性單位是根據中和凝血酶單位的量來確定，凝血酶保存不當效價會降低，故凝血酶標準品應按要求妥善保存，必要時候應重測其效價，以保證結果樣品含量測定的準確性。
（收稿日期：2016-11-01）
