發酵蟲草菌絲體多糖提取條件優化及其結構分析

張麗麗，范琳琳，聶啟興，黃延盛，張全才，殷軍藝，張 爽，聶少平,*

（1.無限極（營口）有限公司，遼寧 營口 115000；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

發酵蟲草菌絲體多糖提取條件優化及其結構分析

張麗麗1，范琳琳2，聶啟興2，黃延盛1，張全才1，殷軍藝2，張 爽1，聶少平2,*

（1.無限極（營口）有限公司，遼寧 營口 115000；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

采用響應面法優化蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖的提取工藝，并對提取所得多糖的結構進行初步分析。結果表明：發酵蟲草菌絲體多糖提取最佳工藝條件為提取溫度98.0 ℃、提取時間4.5 h、液固比25∶1（mL/g），該條件下多糖得率為9.69%。菌絲體多糖主要由中性糖（84.7%）和糖醛酸（9.5%）組成。采用高效體積排阻色譜、紅外光譜掃描和離子色譜對多糖結構進行光譜分析和單糖組成分析，結果表明該多糖主要為分子質量61.6 kD的單一色譜峰且可能呈吡喃環結構。另外，菌絲體多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成，其物質的量比為2.5∶31∶36∶1∶15∶4。研究成果可為日后發酵蟲草菌絲體多糖精細結構與活性研究以及產品開發提供一定理論依據。

發酵蟲草菌絲體多糖；提取工藝優化；響應面；結構分析

冬蟲夏草是指包括冬蟲夏草在內廣義的蟲草屬真菌的總稱，為麥角菌科蟲草屬的藥用真菌。近代研究表明冬蟲夏草具有抗腫瘤、降血壓、增強免疫力、調節內分泌等諸多藥用價值[1-4]，素與人參、鹿茸齊名，享有“東方傳奇式珍寶”的美稱，它也是中國中草藥在世界范圍內最具影響力的神奇中藥之一[5-7]。

由于冬蟲夏草極高的藥用價值以及對生長環境的苛求，天然蟲草的產量已遠遠不能滿足人們的需求，而發酵蟲草菌絲體的研究與開發則成為解決此問題的有效途徑。蝙蝠蛾擬青霉是蟲草中的一種常見內寄生真菌，通過深層發酵，可獲得蝙蝠蛾擬青霉菌絲體。研究表明，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體具有相當天然蟲草的活性功能[8-10]。與天然蟲草相比，人工發酵蟲草菌粉的主要活性物質（如氨基酸、核苷類、蟲草素、多糖等）與天然蟲草在種類上基本一致，但含量和總量上有差異[11-12]。蟲草多糖作為冬蟲夏草中最主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤以及降血糖等功效[2,12-13]，然而，由于來源和發酵批次不同，菌絲體多糖的結構也有很大差異，因此相應的結構分析也是多糖活性研究過程中重要的理論基礎[14-15]。

本研究在單因素試驗的基礎上，以發酵蟲草菌絲體多糖得率為響應值，運用響應面分析法對發酵蟲草菌絲體多糖的提取工藝條件進行優化，為發酵蟲草菌絲體多糖的工業化生產提供理論參考。同時進一步對多糖進行分子質量、單糖組成和紅外光譜等理化性質和組成成分分析，為發酵蟲草菌絲體多糖的進一步開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝙蝠蛾擬青霉菌絲體粉由無限極中國有限公司提供。

單糖標準巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸（均為分析純）、溴化鉀（光譜純） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、醋酸鈉 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備紫外檢測器、示差檢測器） 美國Agilent科技有限公司；Dionex ICS-5000離子交換色譜儀（配備積分脈沖安培檢測器） 美國Dionex公司；高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）儀（配備示差檢測器、黏度監測器、多角度激光光散射檢測器） 美國Wyatt技術公司；XS-105電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團；Nicolet 5700紅外光譜儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草菌絲體多糖提取工藝流程

稱取1 g干燥的蟲草菌絲體粉，按一定液固比加入蒸餾水，按設計的工藝參數進行熱水浴加熱浸提，4 800 r/min離心10 min得上清液，真空濃縮后按80%比例加入無水乙醇，攪拌均勻，4 ℃靜置過夜，4 800 r/min離心，收集醇沉物，干燥后測定其質量[16]。多糖得率計算如下式所示：

1.3.2 單因素及響應面試驗優化設計

分別選取提取時間、液固比、提取溫度3 個因素進行菌絲體多糖提取單因素試驗。在單因素試驗結果基礎上，選取合適的水平，再利用Design-Expert 8.05軟件進行試驗設計，根據中心組合試驗設計原理設計三因素三水平響應面試驗，因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Variables and levels used in the three-factor, three-level response surface design

1.3.3 蟲草精制多糖制備及其結構初步分析

精密稱取發酵蟲草菌絲體干燥粉末300 g，提取多糖。醇沉之后4 800 r/min離心15 min，收集沉淀，沉淀加入蒸餾水復溶，再用Sevag法脫蛋白，反復進行3 次至無蛋白層。然后用蒸餾水透析48 h，冷凍干燥得蟲草菌絲體精制多糖，用于理化性質及結構分析。

1.3.3.1 蟲草多糖的基本化學組成

中性糖含量測定采用苯酚-硫酸法，酸性糖含量測定采用咔唑-乙醇法，蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法，水分測定采用直接干燥法。

1.3.3.2 HPSEC分析

分別采用HPSEC廣譜校正和HPSEC串聯多角度激光光散射的標準方法對蟲草菌絲體多糖的Mw及其分布進行分析[17]。HPSEC串聯多角度激光光散射檢測器、黏度檢測器和示差檢測器。Model 1500 HPLC泵連接兩個分析柱：SB-806 HQ和SB-804 HQ，柱溫35 ℃。流動相為0.2 mol/L NaNO3（含0.02% NaN3），流速為0.6 mL/min，ASTRA 6.1 software采集和分析數據。

1.3.3.3 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜串聯脈沖安培積分檢測器分析蟲草菌絲體多糖單糖組成。分析條件：CarboPacTMPA 20保護柱和CarboPacTMPA 20分析柱（4 mm×250 nm），流動相A為超純水，B為250 mmol/L NaOH溶液，C為1 mol/L NaOAc溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表2，流速為0.25 mL/min。

表2 Dionex色譜系統單糖和糖醛酸的洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for separation of monosaccharidesand uronic acid using Dionex chromatographic system

取多糖樣品5 mg于具塞試管中，冰浴條件下加入0.5 mL 12 mol/L的濃硫酸，冰浴攪拌30 min，然后加水稀釋至3 mL，轉移至100 ℃油浴中水解4 h。水解完成后取出，迅速用冷水冷卻，稀釋后用0.22 μm針孔過濾器過濾后直接進樣分析。單糖標準品配成不同濃度的單標和混標后直接進樣分析，用于判斷和計算樣品中單糖的含量和種類。

1.3.3.4 紅外光譜分析

稱取充分干燥的多糖樣品2 mg與KBr混勻研磨后壓片，上機掃描分析，掃描范圍400～4 000 cm-1[18]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液固比對多糖得率的影響

圖1 液固比對多糖得率的影響Fig. 1 Effect of solvent-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

在固定提取溫度90 ℃、提取時間2 h、提取1 次的條件下，考察液固比對多糖得率的影響，結果如圖1所示。多糖等大分子物質在水中的溶解度與液固比密切相關，隨著液固比的增加，多糖的得率呈現上升趨勢，當液固比小于20∶1時，得率增長較快。當液固比大于25∶1時，上升已趨于平緩。雖然隨著液固比的增加得率有輕微增長，但綜合考慮濃縮以及醇沉的能耗，最佳液固比選擇22∶1為宜。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響

在固定液固比20∶1、提取時間2 h、提取1 次的條件下，考察提取溫度對多糖得率的影響，結果如圖2所示。溫度直接影響物質在水中的溶解度，因此對多糖的得率會有比較明顯的影響。隨著溫度的升高，多糖的得率呈現上升趨勢，當溫度小于95 ℃時，得率增長較快。當溫度大于95 ℃時，得率已趨于平緩。因此，最佳提取溫度選擇95 ℃。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響

圖3 提取時間對多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

在固定液固比20∶1、提取溫度95 ℃、提取1 次的條件下，考察提取時間對多糖得率的影響，結果如圖3所示。隨著時間的延長，多糖得率呈現上升趨勢，當時間大于4 h時，得率已趨于平緩。因此，最佳提取時間選擇4 h。

2.2 發酵蟲草菌絲體多糖提取工藝優化

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results for response surface methodology

依據Design-Expert 8.05軟件中的中心組合設計選項，得到發酵蟲草菌絲體多糖提取的三因素三水平試驗設計及結果，見表3。按照表3數據進行多元回歸方程擬合，可建立以發酵蟲草菌絲體得率（Y）對液固比（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）的擬合方程為：Y=9.59+0.14X1+0.14X2+0.19X3+0.15X1X3+ 0.07X2X3-0.2X12-0.19X2

2-0.28X3

2。對回歸方程進行顯著性檢驗及方差分析結果（表4）表明，模型F值為17.08，極顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P=0.1103），因此可用該回歸方程代替試驗真實點對結果進行分析。相關系數R2為0.9564，表明用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，該模型與實際擬合較好。

表4 發酵蟲草菌絲體多糖提取工藝條件的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for polysaccharides from Paecilomyces hepiali Chen & Dai

從表4可以看出，多糖提取模型建立中一次項和二次項均對多糖得率表現出極顯著影響，交互項X1X3對多糖得率的影響表現為顯著水平，而X1X2和X2X3不具有顯著水平影響。因此，各因素對多糖得率的影響主次順序為：X3（提取溫度）＞X1（液固比）＞X2（提取時間）。

通過軟件求解回歸方程，得出提取工藝最優條件為液固比24.85∶1、提取時間4.48 h、提取溫度97.75 ℃，預測得率為9.71%。考慮到實際的可操作性，選擇液固比25∶1、提取時間4.5 h、提取溫度98.0 ℃，在此條件下進行3次平行實驗，驗證實驗結果顯示發酵蟲草菌絲體多糖得率為（9.69±0.04）%，相對標準偏差為1.5%，提取工藝穩定、可行。

2.3 基本組成分析

表5 發酵蟲草菌絲體多糖組成成分Table 5 Chemical composition of the extracted polysaccharide

表5顯示，發酵蟲草菌絲體多糖中中性糖含量較高，并含有部分糖醛酸（9.5%），離子色譜（圖5）顯示為半乳糖醛酸。除此之外，還含有少量水分和蛋白質。HPSEC（圖4）結果顯示出菌絲體多糖分子質量分布較為集中，有1個較大主峰（峰2），因此，可進一步對多糖進行純化獲得純度更高、均一性更好的多糖純品。

2.4 HPSEC分析

HPSEC串聯多檢測器（多角度激光光散射檢測器、黏度檢測器和示差檢測器）技術已經被廣泛應用于聚合物分子質量和大小的分析。圖4為發酵蟲草菌絲體多糖在不同檢測器下的洗脫曲線，通過ASTRA 6.1 software計算，得到多糖的分子參數，結果如表6所示。色譜峰1處只存在單獨的激光信號，可能是因為發酵蟲草菌絲體多糖中存在極少量的高分子質量多糖組分或聚集體[19]，這些組分的含量很低，在示差等濃度型檢測器中幾乎檢測不出，但是由于分子尺寸大，光散射能力強，在光散射檢測器（尤其是小角度）中可觀察到這些極少量物質的信息。

如表6所示，色譜峰2的數均分子質量Mn和重均分子質量Mw分別34.7、61.6 kD，色譜峰3的Mn和Mw分別26.6 kD和35.8 kD，由此可知色譜峰2和色譜峰3的多分散系數（Mw/Mn）分別為1.77和1.35，表明菌絲體多糖的分子尺寸是一種寬分布且峰2的分子質量分布區間比峰3要更寬。ASTRA軟件分析多糖樣品的構象，即由分子旋轉半徑與分子摩爾數之間的關系曲線可得，該關系曲線用α表示[20-22]。一般認為α在0.5～0.8之間，表明多糖分子呈柔性無規則線團；當α增大，多糖的剛性隨之增強。當α超過1時，表明多糖鏈呈棒狀結構，低于0.3時則呈球形結構[23-24]。發酵蟲草菌絲體多糖的主要成分（峰2）的α值為0.61，因此其結構可能呈柔性無規則線團結構。

2.5 單糖組成分析

圖5 發酵蟲草菌絲體多糖的單糖組成色譜圖Fig. 5 HPAEC chromatogram for the monosaccharide composition ofthe polysaccharide

發酵蟲草菌絲體多糖經酸水解后進離子色譜分析，結果如圖5所示。根據不同單糖標準曲線計算得到，發酵蟲草菌絲體多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成，其物質的量比為2.5∶31∶36∶1∶15∶4，另外還有極少量的巖藻糖和鼠李糖。單糖種類結果與Wu Zhongwei等[25]報道的類似，但是他們所提取的擬青霉多糖中甘露糖含量最高，這種差異可能因為菌種、發酵條件等的不同而導致的。其他有關發酵蟲草菌粉多糖的報道中也有相似的單糖組成[26-27]，表明發酵蟲草菌絲體多糖屬于雜多糖。

2.6 紅外光譜分析

圖6 發酵蟲草菌絲體多糖的紅外圖譜Fig. 6 FI-IR spectrum of the polysaccharide

發酵蟲草菌絲體多糖紅外光譜分析見圖6，菌絲體多糖具有糖類化合物的特征吸收峰3 600～3 200 cm-1， 3 000～2 800 cm-1和1 400～1 200 cm-1。3 448 cm-1處是多糖分子中O—H的伸縮振動，說明存在分子內和分子間氫鍵[28-29]。2 931 cm-1波長處的峰是多糖類C—H伸縮振動，1 417 cm-1之間的吸收峰是多糖類C—H的變角振動[27]。1 652 cm-1為羰基伸縮振動，1 234 cm-1為—COOH中O—H鍵伸縮振動，1 040 cm-1的中等強度的信號峰是C—O—H和吡喃糖環C—O—C中C—O鍵伸縮振動引起的，877 cm-1處的吸收峰說明該多糖以β-糖苷鍵連接[30]。

3 結 論

本研究采用響應面法對發酵蟲草菌絲體多糖的提取工藝條件進行優化，得出菌絲體多糖最佳提取工藝條件分別為提取溫度98.0 ℃、提取時間4.5 h、液固比25∶1，該條件下多糖得率為9.69%。發酵蟲草菌絲體多糖主要為分子質量61.6 kD的單一色譜峰，并且可能呈柔性無規則線團結構。單糖組成結果表明菌絲體多糖主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，紅外光譜表明多糖可能為吡喃環結構。本研究為進一步探討發酵蟲草菌絲體多糖活性與結構的關系提供數據支持，同時也為發酵蟲草菌絲體多糖產品的開發及擴大應用提供初步理論依據。

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Optimization of Extraction and Structural Analysis of Polysaccharide from Paecilomyces hepiali Chen & Dai

ZHANG Lili1, FAN Linlin2, NIE Qixing2, HUANG Yansheng1, ZHANG Quancai1, YIN Junyi2, ZHANG Shuang1, NIE Shaoping2,*
(1. Infintus (Yingkou) Co. Ltd., Yingkou 115000, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Response surface methodology was applied to optimize polysaccharide extraction from Paecilomyces hepiali Chen & Dai. The extracted polysaccharide was structurally elucidated. The optimal extraction conditions were found to be 4.5 h extraction with hot water at 98.0 ℃ at water/material ratio of 25:1 (mL/g). Under these conditions, the maximum polysaccharide yield of 9.69% was obtained and the polysaccharide mainly composed of neutral polysaccharide (84.7%) and uronic acid (9.5%). High performance size exclusion chromatography (HPESC), high performance anion exchange chromatography and FT-IR spectroscopy were used to analyze the structural characteristics of the polysaccharide. Results showed that the molecular weight of the polysaccharide was 61.6 kD, displaying a single chromatographic peak, and its structure contained a pyran ring. In addition, the polysaccharide was composed of arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose and galacturonic acid, with a molar ratio of 2.5:31:36:1:15:4. The findings may be useful for future studies on the structure-activity relationship of polysaccharides from Paecilomyces hepiali Chen & Dai and for the development of new polysaccharide-based products.

polysaccharide from Paecilomyces hepiali Chen & Dai; extraction optimization; response surface methodology; structural analysis

10.7506/spkx1002-6630-201714014

TS201.1

A

1002-6630（2017）14-0091-06

張麗麗, 范琳琳, 聶啟興, 等. 發酵蟲草菌絲體多糖提取條件優化及其結構分析[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 91-96.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714014. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lili, FAN Linlin, NIE Qixing, et al. Optimization of extraction and structural analysis of polysaccharide from Paecilomyces hepiali Chen & Dai[J]. Food Science, 2017, 38(14): 91-96. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714014. http://www.spkx.net.cn

2016-09-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B06）

張麗麗（1986—），女，工程師，碩士，研究方向為保健食品。E-mail：lili.zhang@infinitus-int.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與分析、食品營養與安全、食品復雜碳水化合物。E-mail：spnie@ncu.edu.cn