毛冬青甲素對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶及海馬神經元再生的影響

馬 超，歐陽建，鄭曉婷，李 平,2，成紹武,2*

（1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2.中西醫結合防治心腦疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

毛冬青甲素對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶及海馬神經元再生的影響

馬 超1，歐陽建1，鄭曉婷1，李 平1,2，成紹武1,2*

（1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2.中西醫結合防治心腦疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

目的 探討毛冬青甲素對阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）模型大鼠學習記憶能力及神經元再生的影響。方法 選取雄性SD大鼠24只，以Aβ1-42海馬注射制作AD大鼠模型，隨機分為4組，分別為假手術組、模型組、毛冬青甲素組、陽性藥物組（多奈哌齊）。于造模后第3天起開始干預，連續4周。干預結束后進行Morris水迷宮測試，記錄各組大鼠水迷宮測試期間逃避潛伏期和空間探索實驗中大鼠處于平臺所在區間時間比率；用Brdu標記增殖細胞，并采用免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬組織被標記的增殖細胞表達情況，甲苯胺藍染色法觀察海馬組織錐體細胞Nissl體形態。結果 Morris水迷宮實驗結果表明，與模型組相比，多奈哌齊組、毛冬青甲素組均能縮短潛伏期時間和增加穿越平臺次數，改善其學習記憶能力，差異均有統計學意義（P<0.05）；Brdu標記結果顯示毛冬青甲素能改善海馬齒狀回區神經細胞再生。結論 毛冬青甲素能促進AD模型大鼠神經元再生，且顯著改善AD大鼠空間學習記憶能力。

阿爾茨海默病；毛冬青甲素；學習記憶；神經元再生；Morris水迷宮實驗

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現為特征。現代醫學對本病尚缺乏較理想的治療方法，而中醫對AD的治療卻有其獨特之處。

鄭關毅等[1]研究指出毛冬青甲素可以提高神經營養因子表達和促進神經元干細胞再生。本研究以Aβ海馬注射制作AD大鼠模型，觀察毛冬青甲素對AD大鼠行為學及海馬組織神經元再生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康 SD雄性大鼠 24只，體質量180～220 g。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2013-0005。

1.1.2 主要試劑與儀器 毛冬青甲素購自上海榕柏生物技術有限公司；鹽酸多奈哌齊片購自金日制藥 (中國)有限公司。甲苯胺藍、Brdu購自北京Solarbio科技有限公司；人源性Aβ1-42購自Sigma公司；兔抗Brdu多克隆抗體購自北京Bioss生物技術有限公司；山羊抗兔二抗和DAB試劑盒購自美國Vector公司。MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析測試系統（成都泰盟軟件有限公司）；振動切片機（徠卡，Leica VT1000 S），腦立體定位儀（美國Stoelting公司），顯微鏡（蔡司，Primo Star）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與AD模型制備 大鼠適應性喂養一周后隨機分為4組，分別為假手術組、模型組、毛冬青甲素組、陽性藥物組（多奈哌齊），每組6只。模型組、毛冬青甲素組和陽性藥物組大鼠參考相關文獻[2]制作Aβ海馬注射大鼠模型，將SD大鼠用10%水合氯醛按4 mL/kg的劑量行腹膜麻醉后，固定于腦立體定位儀上，備皮，消毒，沿顱頂中線做1～2 cm切口，分離骨膜，找到前囪位置，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，確定前囟后 3.0 mm，中線旁 2.0 mm 為海馬CA1所在部位體表投影位置，以牙科鉆鉆開一骨窗，微量注射器固定于立體定位儀上，自腦表面垂直進針約2.8 mm，假手術組腦內注射等容量的生理鹽水；其余各組兩側海馬各緩慢均勻注入1 μL Aβ1-42（質量濃度為 10 g/L），5 min 注射完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，縫合皮膚并涂紅霉素軟膏，肌注青霉素，預防感染。清醒后放回籠中常規飼養。

1.2.2 干預方法 大鼠造模后，根據臨床成人推薦劑量，按照體表面積法折算大鼠等效劑量，將毛冬青甲素和多奈哌齊分別溶于生理鹽水，毛冬青甲素組給予 1.35 mg/（kg·d）灌胃，多奈哌齊陽性藥物組給予 0.33 mg/（kg·d）灌胃。假手術組、模型組給予等容量生理鹽水灌胃。每天2次，連續4周。

1.2.3 溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridie,Brdu）標記 干預25 d后，各組大鼠稱質量，將Brdu按照50 mg/kg的劑量，10 mg/mL濃度溶于生理鹽水，腹腔注射2次/d，每次間隔2 h，其中最后一次在處死前24 h注射。

1.3 觀察指標

1.3.1 Morris水迷宮測試 給藥結束后進行水迷宮測試，在水池中注入清水，水面高出平臺2 cm，水中加入適量二氧化鈦，攪拌后使水體呈乳白色不透明狀。水溫控制在(21.0±1.5）℃。平臺置于某一象限中，在其他3個象限中任選一入水點，大鼠面向池壁從A、B、C、D入水點放入水中，觀察其在120 s內尋找到并爬上平臺的時間。若120 s未找到平臺，實驗者將其牽引至平臺上，停留10 s后放回籠中，潛伏期記為120 s，每天定時定點測試2次，連續5 d。第6天撤除平臺，采用空間探索實驗，記錄大鼠在120 s內跨越平臺所在區間的時間。重復2次，取平均值。根據實驗數據對動物的游泳速度進行分析，同時通過可視站臺實驗檢測動物的視力，將游泳能力和視力異常的動物排除。

1.3.2 大鼠海馬組織被標記的增殖細胞檢測 在干預后的第28天處死動物，冰臺上迅速取出大腦組織，放入4%多聚甲醛固定液中固定48 h，將固定好的大腦組織用瓊脂糖包埋固定，采用振動切片機制成厚度50 μm的均勻腦片。免疫組織化學檢測Brdu標記的增殖細胞：TBS清洗5 min×2次；在3%H2O2甲醇液中浸泡30 min；TBS清洗5 min×2次；TBS-A清洗15 min；TBS-B封閉30 min；轉移至96孔板中一抗（1∶100）4℃過夜。第二天TBS-A清洗5 min×2次；TBS-B封閉 15 min； 室溫孵育二抗1 h；TBS-A 清洗 5 min×2 次；TBS-B 封閉 15 min；ABC液孵育1 h；TBS清洗5 min×3次，加入DAB顯色，顯微鏡觀察，顯色明顯時滴加TBS終止反應。將切片梯度酒精和二甲苯脫水透明切片，中性樹脂封片。每個腦組織取3張切片，于40倍物鏡下隨機選取海馬區域5個視野，用Image Pro Plus 6.0圖像處理系統進行細胞計數。

1.3.3 大鼠海馬神經細胞尼氏染色 將厚度50 μm的腦片放置于1%的甲苯胺藍中56℃染色神經元Nissl體，15 s后取出放入 0.5%冰醋酸中分化10 min，在 100%、90%、85%、70%梯度酒精中脫水。二甲苯透明，2 min×2次。中性樹膠封片，每個腦組織取3張切片，在40倍物鏡下觀察海馬CA3區域大鼠海馬神經元的結構變化。

1.4 統計處理

2 結果

2.1 毛冬青甲素對AD模型大鼠空間學習記憶能力的影響

通過Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠空間學習記憶能力的結果顯示，模型組與假手術組相比，大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），顯示造模成功；給予毛冬青甲素和陽性藥物鹽酸多奈哌齊后，能明顯改善AD模型大鼠的學習記憶能力（P＜0.05），且兩組治療效果相當，無統計學差異（P>0.05），見表1。

表1毛冬青甲素對大鼠水迷宮法學習記憶能力的影響 （±s，n=6）

表1毛冬青甲素對大鼠水迷宮法學習記憶能力的影響 （±s，n=6）

注：與假手術組比較#P<0.05；與模型組比較*P<0.05。

組別逃避潛伏期/s第1天 第2天 第3天 第4天 第5天目標象限百分比/%假手術組模型組毛冬青甲素組陽性藥物組94.7±8.3 93.2±7.9 93.8±6.6 94.5±13.5 73.1±9.6 82.3±4.5 72.4±3.2 71.1±6.4 54.1±4.4 77.5±2.6#66.1±4.5*60.8±4.1*32.7±3.4 69.7±3.4#55.6±3.5*46.3±1.8*23.8±2.5 56.4±2.9#44.5±8.8*36.3±5.9*51.1±3.4 29.0±3.2#38.5±3.5*42.2±1.8*

2.2 毛冬青甲素對AD模型大鼠海馬神經元再生的影響

通過Brdu標記增殖神經元結果顯示，假手術組有少量Brdu標記的陽性細胞；模型組Brdu標記的陽性細胞數較少；與模型組比較，毛冬青甲素組和陽性藥物組陽性細胞數顯著增多，見圖1。

圖1各組大鼠海馬組織Brdu標記增殖神經元光鏡圖（×400）

2.3 毛冬青甲素對AD模型大鼠海馬神經元結構的影響

海馬CA3區神經元尼氏染色結果顯示，假手術組海馬CA3區組織結構正常，無病理變化，偶見神經細胞損傷和尼氏體丟失。海馬錐體細胞排列整齊且緊密，胞漿染色清晰，尼氏體豐富。模型組海馬CA3區出現神經細胞變性壞死。海馬錐體細胞數目減少，結構模糊，胞體腫脹，排列散亂，且胞漿內大面積的尼氏體丟失，尼氏體少而小，呈散在分布。毛冬青甲素組與多奈哌齊組海馬CA3區基本病變減輕，同模型組比較，錐體細胞排列較整齊，較緊密，胞漿內尼氏體較豐富，較清晰，見圖2。

3 討論

圖2各組大鼠海馬CA3區神經元Nissl染色圖（×400）

AD是一種起病隱匿的進行性神經系統退行性疾病。隨著我國近年來人口老齡化越來越嚴峻，AD發病率顯著提高，迫切需要展開進一步的發病機制和藥物治療研究。中醫學對于AD早在古代便有所認識，并認為其發生機制是多臟腑共同作用，如腎精不足、髓海虧虛所致的神失所養；肝脾失調，痰濁留滯、蒙蔽腦竅；陽氣虛損、久虛瘀滯造成的腦竅不通引起的神明失職等[3]。毛冬青為冬青科植物毛冬青的干燥根，是我國南方常用的中藥材，味微苦、甘，歸肺、肝、大腸經，具有活血通脈的功效[4]。毛冬青味甘，能補能和能緩，有滋補和中的功效；其善入肝經，能疏肝解郁化痰；活血通脈，疏瘀散滯，活通腦竅，可對癥治療AD。

毛冬青甲素(IlexoninA,IA)是從毛冬青根中提取純化的18-去氫烏索酸經琥珀酰化所得的五環三萜類化合物。張碧琴等[5]研究發現IA對大鼠腦缺血再灌注后Wnt信號通路調控神經再生，得出IA對大鼠腦缺血再灌注后的神經功能有明顯改善作用；韓雨等[6]研究提示IA對大鼠腦缺血再灌注后缺血周邊區 Notch信號的調節作用與神經干細胞增殖和分化。本研究采用Aβ1-42海馬注射后，可導致認知功能障礙，如Morris水迷宮的潛伏期延長，穿越平臺次數減少等表現。實驗結果表明毛冬青甲素組大鼠與模型組大鼠對比，其潛伏期時間減少和穿越平臺次數增加，顯著改善了其學習記憶能力。本研究發現給予毛冬青甲素處理的大鼠其被標記的增殖神經元細胞數高于模型組大鼠，尼氏染色結果也進一步印證了毛冬青甲素具有促進神經元再生的功能。但毛冬青甲素是如何改善AD模型大鼠學習記憶能力和促進神經元再生的具體機制還有待進一步研究。

[1]鄭關毅,石旺清,陳曉東，等.毛冬青甲素對大鼠腦缺血再灌注后bFGF、GAP-43的表達及神經元再生的影響[J].藥學學報,2011,46(9):1065-1071.

[2]朱飛奇,馬 英,錢采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ1-40建立阿爾茨海默病動物模型[J].鄖陽醫學院學報,2008,27(2):106-108.

[3]杜 駿,韓 濤,汪記情，等.阿爾茨海默病發病機制及藥物治療的相關論述[J].國際老年醫學雜志,2014,35(6):268-271.

[4]熊友香,李 昶,羅憲堂.毛冬青的化學成分、藥理作用研究進展[J].中藥材,2002,25(5)：371-374.

[5]張碧琴.毛冬青甲素對腦缺血后經典Wnt通路的調控作用與神經再生[D].福州：福建醫科大學,2014.

[6]韓 雨.毛冬青甲素對腦缺血后Notch通路的調控作用與神經元再生[D].福州：福建醫科大學,2014.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of IlexoninA on Learning-Memory and Neuron Regeneration in the Hippocampal Neuron of Alzheimer's Disease Model Rats

MA Chao1,OUYANG Jian1,ZHENG Xiaoting1,LI Ping1,2,CHENG Shaowu1,2*
（1.Hunan University of Chinese Medicine；2.Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Cardio Cerebral Diseases in Hunan Province,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo investigate the effects of Ilexonin A on neurological behavior and neuron regeneration in Alzheimer'sdisease (AD)modelrats.MethodsThe 24 male SD rats were randomly divided into sham-operation group,model group,Ilexonin A group,positive medicine group(donepezil).Aβ1-42 was injected into hippocampus CA1 region of male SD rats and to establish Alzheimer's disease-like model,then from the 3th day after modeling,the Ilexonin A or Donepezil drug gavage lasted 4 weeks.The learning and memory abilities of the rats were assessed through Morris water maze behavioral test,and neuron proliferation was tested by Brdu label.The expression of proliferative cells in hippocampus tissues was determined by immunohitochemical method.The morphology of hippocampal pyramidal neuron were observed by Nissl staining.ResultsCompared with the model group,the learning and memory of the rats in the drug treated groups sgnificantly increased(P<0.05)and the levels of neuron proliferation were increased in the hippocampal dentate gyrus(DG)region of Ilexonin A treated rats.Conclusion The Ilexonin A reatment can promote neuron regeneration in the hippocampal DG region,and improve the learning and memory ability of the Alzheimer's disease-like model rats.

Alzheimer's disease;Ilexonin A;learning and memory;neuron regeneration;Morris water maze test

R285.5；R741

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.002

2017-04-21

國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201510541008）。

馬 超，男，本科在讀，中西醫臨床醫學專業。

*成紹武，男，教授，碩士研究生導師，E-mail:702058195@qq.com。

本文引用：馬 超，歐陽建，鄭曉婷，李 平，成紹武.毛冬青甲素對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶及海馬神經元再生的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（8）：819-822.