體外產(chǎn)氣法研究不同NFC/NDF底物條件下外源纖維素酶的適宜添加水平

陳光吉，宋善丹，彭忠利*，王普昶，吳佳海，王小利，郭春華，王子苑，高彥華，李小冬，柏雪，付錫三

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；3.樂(lè)至縣科技局，四川 樂(lè)至 641500)

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體外產(chǎn)氣法研究不同NFC/NDF底物條件下外源纖維素酶的適宜添加水平

陳光吉1,2，宋善丹1，彭忠利1*，王普昶2，吳佳海2，王小利2，郭春華1，王子苑2，高彥華1，李小冬2，柏雪1，付錫三3

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；3.樂(lè)至縣科技局，四川 樂(lè)至 641500)

本試驗(yàn)旨在利用體外產(chǎn)氣法研究不同非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber, NFC/NDF)的底物條件下外源纖維素酶(exogenous fibrolytic enzymes, EFE)對(duì)底物產(chǎn)氣、降解和發(fā)酵特性的影響，找出不同底物條件下適宜的EFE添加水平。采用2×5交叉分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，5個(gè)NFC/NDF底物水平 (0.85、1.02、1.19、1.36和1.53)分別添加5種水平的EFE(0, 2, 4, 8 和16 mg/g DM)進(jìn)行體外發(fā)酵。結(jié)果表明，1)不同NFC/NDF底物和EFE水平對(duì)體外總產(chǎn)氣量(GP48)和產(chǎn)氣參數(shù)(b、c和L)均有顯著的影響(P<0.05)，且兩因素互作顯著(P<0.05)；底物1中， GP48、b和c值隨EFE劑量的增加顯著地線性和二次提高(P<0.05)，其中以16 mg/g 水平組較高，L值則呈相反趨勢(shì)；底物2～4中，GP48、b和c值隨EFE劑量增加顯著地二次提高(P<0.05)，其中以4 mg/g 水平組較高。2)不同底物對(duì)干物質(zhì)消失率(DMD)、酸性洗滌纖維降解率(ADFD)、中性洗滌纖維降解率(NDFD)和氮降解率(ND)均有顯著的影響(P<0.05)，除ND外，EFE水平的添加效應(yīng)呈現(xiàn)相似結(jié)果；底物1條件下，隨著EFE添加劑量的提高，DMD、ADFD和NDFD顯著地線性提高(P<0.05)，其中均以16 mg/g組最高(P<0.05)；而底物2～4中則以4 mg/g組最高(P<0.05)。3)不同NFC/NDF底物和EFE水平對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)，除丙酸外，兩種因素對(duì)其他指標(biāo)的互作效應(yīng)均顯著(P<0.05)；在底物1～4條件下，隨著EFE添加劑量的提高，除丙酸以外的其他發(fā)酵參數(shù)顯著地線性和二次提高或降低(P<0.05)；底物1中，對(duì)照組pH值、氨態(tài)氮含量和丁酸摩爾濃度顯著高于4、8和16 mg/g組(P<0.05)，相反，16 mg/g組的總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值較高；底物2～4條件下，pH值和氨態(tài)氮含量以4 mg/g組較低，而TVFA、乙酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值則呈相反的趨勢(shì)。4)NFC/NDF=1.53時(shí)，添加EFE對(duì)體外產(chǎn)氣參數(shù)、降解特性和發(fā)酵特性均無(wú)顯著影響(P>0.05)。由此，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NFC/NDF底物影響了EFE的添加效應(yīng)，NFC/NDF=0.85時(shí)，16 mg/g EFE水平組有較好纖維降解效果；NFC/NDF分別為1.02、1.19和1.36時(shí)，EFE最適添加劑量為4 mg/g；NFC/NDF=1.53時(shí)，底物中添加EFE沒(méi)有正面效應(yīng)。

體外產(chǎn)氣法；NFC/NDF；外源纖維素酶；適宜添加水平

反芻動(dòng)物日糧中，纖維素和半纖維素是最重要的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，瘤胃微生物可以產(chǎn)生催化水解這些碳水化合物的酶，但是這兩種碳水化合物復(fù)雜而致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)制約了反芻動(dòng)物對(duì)它們的消化和利用。為了克服這種因素，很多學(xué)者做出了巨大努力，其中外源纖維素(exogenous fibrolytic enzymes, EFE)在反芻動(dòng)物日糧中的作用研究較多[1-2]，然而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其結(jié)果不盡相同[3-4]。這是由于EFE的作用效果受諸多因素的影響，包括酶的類型和添加量、動(dòng)物飼糧的類型和動(dòng)物的生產(chǎn)水平等[5-6]。因此，研究EFE在反芻動(dòng)物日糧中的適宜添加條件，對(duì)深入了解日糧因素與酶添加形式的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，以及合理利用EFE來(lái)提高日糧結(jié)構(gòu)性碳水化合物利用率具有重要的作用。就日糧因素而言，酶的作用效果因粗料的類型[7-8]、酶的應(yīng)用方法[9-10]以及日糧的結(jié)構(gòu)[5]不同而異。在日糧結(jié)構(gòu)因素中，長(zhǎng)期以來(lái)，人們僅以日糧精粗比這一指標(biāo)來(lái)衡量反芻動(dòng)物的日糧營(yíng)養(yǎng)水平，但因它不能精準(zhǔn)有效反映反芻動(dòng)物日糧的碳水化合物組成而顯得過(guò)于籠統(tǒng)[11]。與日糧精粗比這個(gè)概念相比，非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維 (non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber, NFC/NDF)的比值不僅能準(zhǔn)確反映日糧的碳水化合物的結(jié)構(gòu)，也是反映反芻動(dòng)物瘤胃亞急性酸中毒(subacuteruminal acidosis，SARA)的重要指標(biāo)[12]。然而，目前還未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有關(guān)于日糧NFC/NDF是否影響EFE的作用效果的報(bào)道。

本試驗(yàn)利用體外產(chǎn)氣法，在不同NFC/NDF的底物條件下，研究不同添加量的EFE對(duì)底物的產(chǎn)氣特性、降解特性和發(fā)酵特性變化的影響，進(jìn)一步探究日糧結(jié)構(gòu)與EFE是否存在互作效應(yīng)，以期找出不同碳水化合物組成條件下適宜的EFE添加水平，為EFE在山羊日糧中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 底物及復(fù)合纖維素酶

底物由精料和粗料兩部分組成，粗料為苜蓿(Medicagospp.)草粉和玉米(Zeamays)青貯飼料(2015年7月采集于四川省樂(lè)至縣天龍農(nóng)牧科技有限公司)，配制混合底物前將粗料在60 ℃下烘48 h，過(guò)1 mm篩后與精料配合成NFC/NDF分別為0.85、1.02、1.19、1.36和1.53的混合底物，原料的各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)均為實(shí)測(cè)值，底物原料組成和營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)底物組成及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Ingredients and chemical composition

注：原料組成為風(fēng)干基礎(chǔ)，營(yíng)養(yǎng)成分為干物質(zhì)基礎(chǔ)。

Note: Ingredient composition with air dried basis and nutrient composition with DM basis.

EFE為纖維素酶和木聚糖酶的復(fù)合粉劑，購(gòu)自上海尤特爾生化有限公司。試驗(yàn)前，參照Colombatto等[13]的方法測(cè)定了外源酶的纖維素酶和木聚糖酶活力：在pH為5.5和39 ℃條件下，纖維素酶和木聚糖酶活力分別為8563.50 IU/g和3585.6 IU/g。

1.2 瘤胃液采集

2015年9月在四川省樂(lè)至縣天龍農(nóng)牧科技有限公司種羊場(chǎng)選取6只體重接近[(25±0.32) kg]的健康川中黑山羊(樂(lè)至型)育肥公羊，在精粗比為50∶50的日糧條件下飼喂兩個(gè)月后，于晨飼前屠宰取瘤胃液。將每頭羊瘤胃液混合并用6層0.125 mm紗布過(guò)濾后立即裝入保溫瓶中通入CO2保持厭氧條件，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用2因子5水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，底物的NFC/NDF和EFE添加水平作為兩個(gè)試驗(yàn)因素。 NFC/NDF分別為0.85、1.02、1.19、1.36和1.53，EFE添加量分別為：0, 2, 4, 8和16 mg/g DM，即底物纖維素酶活力含量分別為0, 17, 34, 68, 136 IU/g DM；木聚糖酶活力含量分別為0, 7, 14, 28, 56 IU/g DM。試驗(yàn)共25個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.4 體外產(chǎn)氣試驗(yàn)

參照Menke[14]的方法配制緩沖液，將其置于39.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入CO2，現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確稱取500 mg EFE 溶于緩沖液中(pH=6.5)，用玻璃棒攪拌均勻，配制成濃度為5 mg/mL的酶溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，試驗(yàn)前將酶溶液放入恒溫水浴鍋中37 ℃水浴30 min。分別準(zhǔn)確稱取700 mg底物并用移液槍吸取相應(yīng)量的酶液置于100 mL玻璃刻度注射器底部(成都圣欣科學(xué)儀器有限公司)，然后吸入50 mL預(yù)先于39.5 ℃恒溫水浴鍋保溫的混合培養(yǎng)液[瘤胃液∶人工唾液=1∶4(V/V)]，輕微震蕩搖勻后置于(39±0.5) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照管(僅含有混合培養(yǎng)液)以減少系統(tǒng)誤差；每個(gè)重復(fù)設(shè)置3個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)束后將同一個(gè)處理的3個(gè)平行樣品中的液相和固相分別混合后取樣，以防止剩余的干物質(zhì)量不足以測(cè)定后續(xù)指標(biāo)。

發(fā)酵過(guò)程中，記錄3, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36, 40, 48 h時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量，記錄過(guò)程中每間隔2 h搖勻一次(由于劇烈發(fā)酵后會(huì)出現(xiàn)固液相分開(kāi)的現(xiàn)象)，產(chǎn)氣量刻度超過(guò)80 mL后推動(dòng)活塞至初始刻度。培養(yǎng)48 h后立即用冰水浴終止發(fā)酵，將同一個(gè)處理的3個(gè)平行樣品中的培養(yǎng)液無(wú)損的移至50 mL離心管中，立即用PHB-5型便攜式pH計(jì)(杭州天威工貿(mào)有限公司)測(cè)定培養(yǎng)液pH值；然后吸取1 mL培養(yǎng)液進(jìn)入2 mL EP 管中加入1 mL 100 g/L的偏磷酸用于揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)含量的測(cè)定(氣相色譜外標(biāo)法，日本島津CMG-QP2010，色譜柱CP-WAX：長(zhǎng) 30 m，內(nèi)徑 0.53 mm，膜厚 1 μm)，乙酸、丙酸及正丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)均購(gòu)于Sigma公司；另取1 mL培養(yǎng)液加入1 mL 0.5 mol/L的HCl用于氨態(tài)氮(NH3-N)含量的分析(分光光度計(jì)購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，DR/5000)。最后將離心管于3000 r/min下離心15 min，并用熱水洗滌培養(yǎng)液固相殘留物，然后無(wú)損的轉(zhuǎn)移至預(yù)先恒重的輕質(zhì)鋁盒中，于65 ℃烘箱中烘48 h，然后將同一處理的3個(gè)平行風(fēng)干樣混合，用于干物質(zhì)消失率(dry matter disappearance rate, DMD)、酸性洗滌纖維降解率(acid detergent fiber degradation rate, ADFD)、中性洗滌纖維降解率(neutral detergent fiber degradation rate, NDFD)和氮降解率(nitrogen degradation rate, ND)的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及計(jì)算方法

各處理底物和培養(yǎng)液固相殘留物中DM、Ash和N含量的測(cè)定參照張麗英[15]的方法， ADF和NDF含量參照Van Soest等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。培養(yǎng)液中VFA和NH3-N含量參照Carro等[17]的方法測(cè)定。

其中VFA測(cè)定的色譜條件：載氣為氦氣，流量為2 mL/min，分流比為10∶1。采用程序升溫，初始溫度為120 ℃，以8 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min，離子源溫度為230 ℃。進(jìn)樣口溫度為210 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

1.5.1 產(chǎn)氣量的計(jì)算

產(chǎn)氣量(mL)=該時(shí)間段內(nèi)培養(yǎng)管產(chǎn)氣量(mL)-對(duì)應(yīng)空白管產(chǎn)氣量(mL)

1.5.2 產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù) 參照France等[18]提出的計(jì)算模型:GP=b×[1-e-c(t-L)]，調(diào)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件中非線性回歸程序(Nonlinear)進(jìn)行產(chǎn)氣參數(shù)估計(jì)。式中：GP表示培養(yǎng)t時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量(mL)，e為自然對(duì)數(shù)，t為培養(yǎng)時(shí)間(h)，b為潛在最大產(chǎn)氣量(mL/g DM)，c表示產(chǎn)氣速率(mL/h)，L表示開(kāi)始產(chǎn)氣前的延滯時(shí)間(h)。

1.5.3 DMD、 ADFD、 NDFD和 ND計(jì)算方法

DMD (%)=(A-B)/A×100

式中：A為發(fā)酵前樣品干物質(zhì)重；B為發(fā)酵48 h后殘?jiān)晌镔|(zhì)重。

ADFD (%)=(ADF前×A-ADF后×B)/ADF前×A×100

式中：ADF前為發(fā)酵前的ADF含量；ADF后為發(fā)酵48 h后ADF的含量；NDFD和ND的計(jì)算方法與ADFD的計(jì)算方法相同。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

將不同NFC/NDF水平和EFE添加水平作為兩個(gè)因素，用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性模型(general linear models, GLM)，選用交互模型進(jìn)行兩因素方差分析，分別得出兩個(gè)因素對(duì)各項(xiàng)體外發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)的主效應(yīng)和互作效應(yīng)；再調(diào)用GLM程序分別對(duì)各個(gè)底物不同酶水平進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，然后用線性估計(jì)(curve estimation)程序?qū)ο嗤孜锵虏煌杆降脑囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行線性(Linear)和二次函數(shù)(Quadratic)的顯著性檢驗(yàn)。以P<0.05代表差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值表示，變異程度用標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外產(chǎn)氣參數(shù)

由表2可見(jiàn)，不同NFC/NDF底物和EFE水平對(duì)體外總產(chǎn)氣量(GP48)和產(chǎn)氣參數(shù)(b、c和L)均有顯著的影響(P<0.05)；且兩因素互作顯著(P<0.05)。相同底物條件下，底物1中， GP48、b和c值隨EFE劑量增加顯著地線性和二次提高(P<0.05)，其中以16 mg/g 水平組較高，L值則顯著地線性降低(P<0.05)，同樣以16 mg/g 水平組最低；底物2中，GP48、b和c值隨EFE劑量增加顯著地二次提高(P<0.05)，其中以4 mg/g 水平組較高，底物3和底物4呈相似的趨勢(shì)；底物5中，EFE添加水平對(duì)GP48和產(chǎn)氣參數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。

續(xù)表2 Continued Table 2

注：同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。1)底物分別表示NFC/NDF為0.85、1.02、1.19、1.36和1.53。下同。

Note: Different letters in the same column mean significant differences between the treatments (P<0.05), same letter in the same column or no letter means not significant difference between treatments (P>0.05).1)The substrates showed that the NFC/NDF ratio were 0.85, 1.02, 1.19, 1.36 and 1.53, respectively. The same below.

2.2 底物降解特性

從表3可知，不同底物對(duì)DMD、ADFD、NDFD和ND均有顯著的影響(P<0.05)，除ND外，EFE水平的添加效應(yīng)呈現(xiàn)相似結(jié)果。底物1條件下，隨著EFE添加劑量的提高，DMD、ADFD和NDFD顯著地線性提高(P<0.05)，其中均以16 mg/g組最高；底物2～底物4中，隨著EFE添加劑量的提高，DMD、ADFD和NDFD顯著地二次函數(shù)提高(P<0.05)，其中均以4 mg/g組最高；底物5條件下，EFE添加劑量對(duì)底物降解特性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

表3 不同NFC/NDF底物條件下不同EFE水平對(duì)底物降解特性的影響Table 3 Effects of different levels of exogenous fibrolytic enzymes on the degradation characteristics of substrates with different NFC/NDF ratios %

續(xù)表3 Continued Table 3

2.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表4可看出，不同NFC/NDF底物和EFE水平對(duì)瘤胃pH、氨態(tài)氮含量、總揮發(fā)性脂肪酸(total voltatile fatty acid,TVFA)濃度、乙酸、丙酸、丁酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值均有顯著影響(P<0.05)，除瘤胃丙酸外，兩種因素對(duì)其他瘤胃發(fā)酵參數(shù)均有顯著的互作效應(yīng)(P<0.05)。在底物1～4條件下，隨著EFE添加劑量的提高，除丙酸和丁酸外，各發(fā)酵參數(shù)顯著地線性或二次提高或降低(P<0.05)。底物1中，對(duì)照組pH值、氨態(tài)氮含量和丁酸濃度顯著高于4、8和16 mg/g組(P<0.05)，相反，16 mg/g組的TVFA和乙酸濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，乙酸∶丙酸值同樣以16 mg/g EFE水平組較高，與4 mg/g組差異不顯著(P>0.05)；底物2、底物3和底物4條件下，pH值和氨態(tài)氮含量以4 mg/g組較低，而TVFA、乙酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值則呈相反的趨勢(shì)；底物5中，EFE添加劑量對(duì)發(fā)酵參數(shù)無(wú)顯著影響。

表4 不同NFC/NDF底物條件下不同外源酶水平對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of different levels of exogenous fibrolytic enzymes on the rumen fermentation parameters of substrates with different NFC/NDF ratios

續(xù)表4 Continued Table 4

3 討論

3.1 不同NFC/NDF的底物條件下EFE水平對(duì)體外產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)和底物降解特性的影響

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)含有能分解纖維類物質(zhì)的極為復(fù)雜的微生物體系，微生物在發(fā)酵飼糧后會(huì)代謝產(chǎn)生由CH4、NH3、CO2、H2和N2等組成的混合氣體，故產(chǎn)氣量綜合體現(xiàn)了發(fā)酵底物被微生物利用的程度。許多研究表明，在反芻動(dòng)物日糧中添加外源酶制劑，可以促進(jìn)酶與底物結(jié)合，從而提高飼料的利用率[19-21]。但對(duì)EFE能否提高或者降低GP，報(bào)道的結(jié)果卻不盡相同。Eun等[20]的體外發(fā)酵研究結(jié)果顯示，在苜蓿干草中添加內(nèi)切及外切葡聚糖酶、木聚糖酶以及蛋白酶均能促進(jìn)苜蓿干草的GP48累積，同時(shí)還提高了苜蓿干草的DMD及纖維降解率。Yang等[22]利用體外發(fā)酵研究外源酶制劑對(duì)以苜蓿和稻草秸稈為發(fā)酵底物的降解率的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加酶制劑可以提高48 h的總GP，并能促進(jìn)DM和纖維的降解。本研究中，在各底物條件下，EFE水平對(duì)GP48、體外潛在最大產(chǎn)氣量(b值)和產(chǎn)氣速率(c值)均有顯著的線性或二次函數(shù)的影響，但趨勢(shì)不盡相同，隨著EFE添加量的遞增，GP出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，即EFE水平過(guò)高GP48反而降低，這正如Elghandour等[23]的觀點(diǎn)所述，只有適宜的EFE添加水平方能提高瘤胃發(fā)酵效率。而Nsereko等[24]認(rèn)為在同樣飼糧條件下，適宜的EFE水平能改善瘤胃的發(fā)酵效率或刺激瘤胃良性發(fā)酵，從而提高GP、c值及底物降解率。但也有研究認(rèn)為酶制劑的添加對(duì)產(chǎn)氣量幾乎沒(méi)有影響[18]。產(chǎn)生不一致的原因可能是酶添加劑量的不同以及適合與不同底物所匹配的酶不一樣。

盡管反芻動(dòng)物瘤胃微生物能分泌大量可以破壞纖維素及半纖維素中糖苷鍵的酶，但許多研究均證實(shí)添加EFE可提高纖維的降解[21]。從本試驗(yàn)中GP48的差異便可推知，與對(duì)照組相比，添加EFE可促進(jìn)纖維降解。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NFC/NDF=0.85時(shí)，添加16 mg/g的EFE具有較高的GP和纖維降解率，而底物NFC/NDF分別為1.02、1.19、1.36時(shí)，添加4 mg/g EFE則效果更好，這表明底物NFC/NDF與EFE的添加水平存在互作效應(yīng)。其原因則要追溯到EFE的作用機(jī)理上，EFE對(duì)纖維素進(jìn)行降解首先要吸附到纖維素上，纖維素酶分子通過(guò)纖維素結(jié)合域吸附到纖維素晶體表面，然后催化結(jié)構(gòu)域催化糖苷鍵的斷裂從而實(shí)現(xiàn)纖維素的降解。而NDF含量高的底物具有較大的纖維素晶體表面積，從而可吸附更多的纖維素結(jié)合域，因此有更高水平的纖維素酶能發(fā)揮作用[25]。此外，本試驗(yàn)中，在不同底物里添加EFE對(duì)ND無(wú)顯著影響。此結(jié)果與Awawdeh等[26]報(bào)道的在羔羊飼糧中添加EFE，對(duì)羔羊氮利用率和氮沉積率無(wú)影響的結(jié)果一致。相反，Gado等[19]在奶牛的飼喂試驗(yàn)中得出不同的結(jié)果，在奶牛飼糧中添加40 g/d的EFE，提高了飼糧N利用率。造成這些結(jié)果不一致的原因可能是纖維素酶的來(lái)源不同(Gado等[19]所使用的EFE為瘤胃厭氧菌培養(yǎng)產(chǎn)生)，還可能與動(dòng)物品種差異有關(guān)，因此在具體應(yīng)用時(shí)，要根據(jù)酶制劑和動(dòng)物類型進(jìn)行合理選擇。

3.2 不同NFC/NDF的底物條件下EFE對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

pH值是反應(yīng)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵水平最直觀指標(biāo)，大量研究證實(shí)，瘤胃液中VFA濃度的增加是導(dǎo)致pH下降的主要因素，其次為乳酸[27-28]。本試驗(yàn)研究表明，在底物1～4條件下，TVFA濃度隨EFE水平的提高呈線性或二次函數(shù)升高的趨勢(shì)，這可能是導(dǎo)致pH值線性或二次降低的原因，本試驗(yàn)中底物1～4條件下，培養(yǎng)液pH值在5.83～6.52，而高于亞急性瘤胃酸中毒(SARA)5.5～5.8的閥值[29]，而在底物5中，pH值在5.73～5.88，接近SARA閥值，原因可能是本試驗(yàn)采用的體外培養(yǎng)裝置不是連續(xù)型培養(yǎng)系統(tǒng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)管內(nèi)VFA和乳酸等物質(zhì)積累而無(wú)法吸收和排出導(dǎo)致pH值處于較低的水平。另外，TVFA的濃度的高低依賴于底物碳水化合物的結(jié)構(gòu)和降解程度，在同樣的NFC/NDF條件下，本試驗(yàn)中EFE水平影響了DMD、ADFD和NDFD，故影響了TVFA，這與Arriola等[30]的結(jié)果一致，而不同的底物條件下的TVFA結(jié)果和相應(yīng)降解特性結(jié)果相吻合，即底物1條件下，以16 mg/g EFE水平組較高，底物2～4以4 mg/g酶水平較高。對(duì)于單VFA，除底物5外，其余底物處理組中，乙酸摩爾濃度的變化趨勢(shì)與TVFA基本一致，丁酸呈相反趨勢(shì)，而丙酸摩爾濃度未發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致乙酸∶丙酸值出現(xiàn)相應(yīng)的變化，即隨著底物碳水化合物降解率的提高，VFA中乙酸比例提高，丙酸不變，丁酸比例降低，乙酸∶丙酸值提高，可見(jiàn)，酶水平改變了瘤胃的發(fā)酵模式，這與Giraldo等[31]和Romero等[32]報(bào)道的結(jié)果一致。

值得注意的是，當(dāng)NFC/NDF=1.53(底物5)時(shí)，酶水平未影響底物產(chǎn)氣特性、降解特性和發(fā)酵特性，這可能是當(dāng)NFC/NDF提高到一定值時(shí)，快速發(fā)酵的碳水化合物含量過(guò)高，迅速發(fā)酵后促使培養(yǎng)液pH快速降低從而抑制了纖維類降解菌的生長(zhǎng)[33]，而同時(shí)外源纖維素酶吸附到結(jié)構(gòu)性碳水化合物上后首先催化致密的纖維結(jié)構(gòu)變得疏松而部分水解，但水解產(chǎn)物并沒(méi)有完全被降解纖維類的微生物所利用，而影響了產(chǎn)氣特性和降解特性。瘤胃中氨氮濃度是反應(yīng)飼糧代謝的重要指標(biāo)，是瘤胃微生物可利用的主要氮源，在同樣的日糧蛋白質(zhì)水平下，瘤胃中氨態(tài)氮濃度越低表征微生物利用率越高，菌體蛋白產(chǎn)量越高[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各NFC/NDF的底物條件下，瘤胃液中氨態(tài)氮含量變化趨勢(shì)與相應(yīng)TVFA的趨勢(shì)一致，即底物1條件下呈線性和二次函數(shù)降低的趨勢(shì)，以16 mg/g 外源酶水平組最低，底物2～4均以4 mg/g酶水平較低，說(shuō)明瘤胃氨態(tài)氮的利用率分別在上述酶水平條件下較高，原因可能是適宜的酶水平提高了結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解率，從而產(chǎn)生較高的TVFA濃度，為微生物的生長(zhǎng)提供更多的可利用能進(jìn)而提高了氨態(tài)氮利用率[35]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下， NFC/NDF底物影響了EFE的添加效應(yīng)，NFC/NDF=0.85時(shí)，16 mg/g EFE水平組有較好纖維降解效果；NFC/NDF分別為1.02、1.19和1.36時(shí)，EFE最適添加劑量為4 mg/g；NFC/NDF=1.53時(shí)，底物中添加EFE沒(méi)有正面效應(yīng)。

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Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based oninvitrogas production

CHEN Guang-Ji1,2, SONG Shan-Dan1, PENG Zhong-Li1*,WANG Pu-Chang2, WU Jia-Hai2, WANG Xiao-Li2, GUO Chun-Hua1, WANG Zi-Yuan2, GAO Yan-Hua1, LI Xiao-Dong2, BAI Xue1, FU Xi-San3

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestMinzuUniversity,Chengdu610041,China; 2.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 3.BureauofScienceandTechnology,SichuanProvince,Lezhi641500,China

The objective of this study was to determine the appropriate level of exogenous fibrolytic enzyme (EFE) supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber (NFC/NDF) ratios. The experiment had a cross group design with two factors and five levels. Five substrates with different NFC/NDF ratios (0.85, 1.02, 1.19, 1.36, and 1.53; sub1-5) were supplemented with EFE at five levels (0, 2, 4, 8, and 16 mg/g dry matter/DM) andinvitrogas production, degradation, and fermentation profiles were determined. The results can be summarized as follows: 1) The NFC/NDF ratio influenced totalinvitrogas production (GP48) and gas production parameters (b, c, and L) (P<0.05). The interaction between NFC/NDF ratio and EFE level was significant for gas production parameters (P<0.05).In sub1, as the EFE level increased, GP48, b, and c increased (linear and quadratic effect,P<0.05), and the highest GP48, b, and c were in the 16 mg/g EFE treatment; L showed the opposite trend. In the sub2-4 treatments, the highest GP48, b, and c were in the 4 mg/g EFE treatment. 2) The NFC/NDF ratio in the substrate significantly affected the dry matter disappearance rate (DMD), acid detergent fiber degradation rate (ADFD), neutral detergent fiber degradation rate (NDFD), and nitrogen degradation rate (ND) (P<0.05). The additive effects of EFE produced similar results, except for ND. In sub1, as the EFE dose increased, DMD, ADFD, and NDFD linearly increased (P<0.05). The maximum values of DMD, ADFD, and NDFD were in the 16 mg/g EFE treatment in sub1 and in the 4 mg/g EFE treatment in sub2-4 (P<0.05). 3) The fermentation profile differed significantly among substrates with different NFC/NDF ratios and different levels of EFE supplementation (P<0.05), and the two factors had a significant interaction effect (P<0.05) for all fermentation parameters, except for propionate. For sub1-4, as the EFE levels increased, the fermentation profiles of all parameters except for propionate increased or decreased (quadratic effect,P<0.05). In sub1, pH, ammonia-N, and the butyrate molar concentration were higher in the control group than in the 4, 8 and 16 mg/g EFE treatments, but the acetate molar concentration and acetate∶propionate ratio were higher in the 16 mg/g EFE treatment. The sub2-4 treatments showed lower pH and ammonia-N, and higher total volatile fatty acid (TVFA), acetate molar concentration, and acetate∶propionate ratio. 4) In the substrate with NFC/NDF=1.53, EFE supplementation had no effect oninvitrogas production, fiber degradation, or fermentation characteristics (P>0.05). The results of this study showed that the NFC/NDF ratio influenced the response to EFE supplementation; NFC/NDF=0.85, 16 mg/g EFE showed the best fiber degradation, and the optimum EFE dose was 4 mg/g for substrates with NFC/NDF ratios of 1.02, 1.19, and 1.36. There was no positive effect of EFE on the substrate with NFC/NDF=1.53.

invitrogas production; NFC/NDF; exogenous fibrolytic enzymes; appropriate supplementary dose

10.11686/cyxb2017055

2017-02-20；改回日期：2017-04-10

“科技部科技富民強(qiáng)縣專項(xiàng)：川中黑山羊(樂(lè)至型)健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)集成與示范”，科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目“貴州省喀斯特山區(qū)草地培育與養(yǎng)殖管理科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)”(黔科合平臺(tái)人才[2016]5617)和黔科合重大專項(xiàng)字(2014)6017號(hào)資助。

陳光吉(1990-)，男，貴州遵義人，碩士。E-mail:cgjgz09@126.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: leo3131@163.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

陳光吉, 宋善丹, 彭忠利, 王普昶, 吳佳海, 王小利, 郭春華, 王子苑, 高彥華, 李小冬, 柏雪, 付錫三. 體外產(chǎn)氣法研究不同NFC/NDF底物條件下外源纖維素酶的適宜添加水平. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(7): 116-127.

CHEN Guang-Ji, SONG Shan-Dan, PENG Zhong-Li, WANG Pu-Chang, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li, GUO Chun-Hua, WANG Zi-Yuan, GAO Yan-Hua, LI Xiao-Dong, BAI Xue, FU Xi-San. Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based oninvitrogas production. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 116-127.