黃腐酸促進超氧化物歧化酶形成的作用機制探究

張彩鳳 吳云彬 宋 珍

黃腐酸促進超氧化物歧化酶形成的作用機制探究

張彩鳳1,2吳云彬1宋 珍1

(1 太原師范學院化學系 晉中 030619 2 山西省腐植酸工程技術研究中心 晉中 030619)摘 要：本論文利用Discovery Studio 4.5初步探討了腐植酸中的黃腐酸促進超氧化物歧化酶形成的作用機制。黃腐酸作為一種生物刺激素已被廣泛的應用于農業生產，并且很多研究表明，黃腐酸在植物的許多生理過程中起了非常重要的作用。實驗數據顯示，在一定濃度范圍內，黃腐酸對玉米幼苗葉片中超氧化物歧化酶的形成有一定的促進作用。通過分子模擬軟件Discovery Studio 4.5對機理的研究表明，這是由于黃腐酸先與植物中的鈣調蛋白結合，形成較為穩定的配合物，后再與超氧化物歧化酶作用，降低了酶本身的能量，不僅使其更容易被合成，同時還增加了它與其他物質的親和力。

腐植酸 黃腐酸 鈣調蛋白 超氧化物歧化酶(SOD)

腐植酸(Humic acid，HA)，是一種在自然界中普遍存在且較為易得的大分子有機物，它是動、植物遺骸經過十分漫長的地質過程，并由一系列微生物分解轉化而形成的一種天然有機質。腐植酸的種類有很多，其中黃腐酸由于其較小的分子量，非常容易被生物吸收。除此，腐植酸還含有較多的活性基團，如酮羰基和酚羥基，因此易于以氫鍵的形式與大分子物質結合，而這一點又非常有利于我們進行接下來的一系列探究。

大量的研究表明，將黃腐酸培養液噴灑在農作物的表面，能夠顯著地提高被噴灑農作物的產量[1～3]，而對于農作物以外的其他植物，則可以非常明顯地促進其生長發育[4]。與此同時，大量的研究實例也證明，黃腐酸在植物的養分轉化方面具有一定的促進作用，如作為一種新型的生物刺激素，它能夠刺激植物體內酶的活性，特別是對植物細胞內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及過氧化物酶(POD)具有明顯的作用[5～8]。實驗數據顯示，在一定范圍內，隨著黃腐酸濃度的增加，玉米幼苗葉片中SOD的含量也呈現增加的趨勢[9]。

而據文獻顯示，廣泛存在于植物體內的一種受體蛋白——鈣調蛋白可以刺激SOD的生成[10]。鈣調蛋白是一種鈣受體蛋白，它可以通過與鈣離子的結合，形成鈣-鈣調蛋白復合物(Calcium-Calmodulin Complex)。與此同時，鈣調蛋白的構型也會相對地發生一些變化，成為一些酶如SOD的激活物。SOD被激活后，它便能更好地催化如下反應的進行：2O2-+2H+→H2O2+O2。這樣一來，存在于生物體內的有害物質——超氧陰離子自由基就可以得到很好的清除[10]，因為超氧陰離子O2-的濃度過高會導致氧化從而損壞生物自身組織[11]，所以其累積含量越少對植物的生長越有利。

因此，玉米幼苗葉片中SOD含量的增加與黃腐酸和鈣調蛋白有關，但由于黃腐酸也可以與鈣調蛋白發生相互作用[9]，所以就目前的研究來看是無法確定其作用機制在三者都參與的情況下具體是按怎樣的途徑來進行的。由此可提出以下三種假設來進行機理的探討。

第一，黃腐酸與鈣調蛋白形成配合物后再與SOD相互作用；

第二，鈣調蛋白直接與黃腐酸-SOD配合物相互作用；

第三，黃腐酸-鈣調蛋白配合物與黃腐酸-SOD配合物發生相互作用。

但想要證明這些，通過宏觀的實驗是無法做到的，必須從微觀的角度來進行。因此，本論文利用近些年來被廣泛使用的基于統計力學和量子力學[12]的計算機分子模擬技術，通過Discovery Studio 4.5軟件，從以上的三種假設出發，用分子對接(Molecular Docking)、結合能(Binding Energy)計算以及分子動力學(Molecular Dynamics，MD)模擬來初步探討黃腐酸促進SOD形成的作用機制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

本論文中對接所使用的黃腐酸3D模型來自PUBCHEM數據庫，鈣調蛋白和SOD的3D模型則來自PDB數據庫。此次實驗用馬鈴薯的鈣調蛋白、番茄的SOD來近似代替所有植物的這兩種蛋白結構進行計算機分子模擬。

1.2 材料的預處理

對于直接從PUBCHEM數據庫中下載所得的黃腐酸分子，要先在Small Molecules中進行優化(Full Minimization)，目的是將其優化為能量最低的合理構象，然后通過Prepare or Filter Ligands面板，找到其可能存在的、所有的同分異構體，為下一步分子對接(Molecular Docking)做準備。

對于直接從PDB數據庫中下載所得的鈣調蛋白和SOD，則要先去除蛋白質所攜帶的水分子，然后點擊軟件的Prepare Protein面板，使系統自動優化和補全蛋白結構，最后通過From Receptor Cavities選項，找到蛋白質的活性位點(即最有可能與配合物或是另一蛋白質發生相互作用或結合的部位。多數情況下，軟件會定位于蛋白質的空腔部分)，為下一步的分子對接(Molecular Docking)做準備。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗所用軟件

本論文進行計算機分子模擬所用的軟件為美國Accery 公司自主研發的Discovery Studio 4.5，即藥物發現與生物大分子計算模擬平臺4.5版本。Discovery Studio(簡稱DS)，它主要服務于生命科學領域，用于蛋白質結構的研究及新藥的發現。它主要包含四大板塊：生物大分子板塊(如蛋白質中氨基酸的序列分析、蛋白質結構的優化和活性位點的預測等)、計算化學板塊(如分子動力學計算以及分子動力學模擬等)、基于靶標結構藥物設計板塊(如基于靶標結構的化合物虛擬篩選以及蛋白與蛋白、蛋白與有機化合物配體的對接等)和基于配體藥物設計板塊。

1.3.2 小分子與大分子的對接及動力學模擬

小分子與大分子對接所依據的原理為Fischer E所提出的鎖匙原理，根據CHARMm力場(簡單點說其實就是幾何匹配和能量匹配)，尋找兩分子間的最佳匹配(互相作用)模式。在這里小分子指的是黃腐酸，大分子則是指鈣調蛋白以及SOD。在軟件的Receptor-Ligand Interactions面板中找到Dock Ligands(CDOCKER)選項設置好對接參數，然后點擊RUN開始運行，數分鐘后，即可得到對接結果。

將對接好的黃腐酸-鈣調蛋白和黃腐酸-SOD配合物根據牛頓力學來進行分子動力學模擬，它主要包括以下四個過程：模擬體系的升溫過程(Heating Stage)、模擬體系的平衡過程(Equilibrium Stage)、模擬體系的采樣過程(Production Stage)以及分析體系的目標性質(Analysis)。然后在Simulations面板中溶劑化蛋白、設置束縛和修改動力學參數，最后點擊RUN開始運行，數小時后即可得到模擬結果。

1.3.3 大分子與大分子的對接

大分子與大分子對接所依據的原理仍為鎖匙原理，但有所不同的是，它是基于快速傅立葉轉化相關性技術的一種剛性蛋白對接算法。算法中快速傅立葉轉化相關性技術被用于搜索蛋白-蛋白對接系統的平動和轉動空間。此次實驗采用的采樣角度為6度，由于角度較小，因此采樣較多，預測結果也更為準確。在這里，大分子指的是鈣調蛋白和SOD，或是黃腐酸-鈣調蛋白和黃腐酸-SOD配合物。在軟件的Macromolecules面板中找到Dock Protein(ZDOCKER)選項設置的對接參數，然后點擊RUN開始運行，數小時后，即可得到對接結果。

1.3.4 結合能的計算

在軟件的Receptor-Ligand Interactions面板中找到Calculate Binding Energy選項，然后點擊計算結合能。

1.4 數據處理

在View Result中調出計算數據與圖表，分析所得結果。

2 結果分析

2.1 黃腐酸-鈣調蛋白及黃腐酸-SOD配合物和它們的動力學模擬

近年來，隨著消費升級的不斷深入，格蘭仕順應市場需求，也憑借著強大的研發、制造能力，不斷推出了一系列的高端家電產品，其中雙變頻微波爐及微蒸烤一體機更是其突出的代表性產品。

從圖1可以看出，黃腐酸分子中一共有4個羥基，2個羰基及2個含氧環，它們都是能夠形成氫鍵的基團。而圖2中所顯示的黃腐酸分子能夠給出或是接受H的部分與它所含有的基團都是相對應的，如：粉色代表能夠給出氫的部分，從2D效果圖可以看出這是羥基所在的位置；綠色代表能夠接受氫的部分，從2D效果圖可以看出這是羰基和含氧環所在的位置。

圖1 黃腐酸分子(2D)Fig.1 Fulvic acid(2D)

圖2 黃腐酸分子表面能形成氫鍵區域示意圖Fig.2 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds with other macromolecular substances

圖2 黃腐酸分子表面能形成氫鍵區域示意圖

Fig.2 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds with other macromolecular substances

圖3和圖4分別是黃腐酸與鈣調蛋白和SOD的對接結果示意圖，圖中紅色區域為最有可能的活性位點，綠色部分的作用則如同數學中的坐標一樣，黃腐酸分子就是在其中按“坐標”逐個移動以尋找最佳(即不僅能量最低且又具有一定的合理性)的對接部位。

圖5顯示的是黃腐酸與鈣調蛋白對接后兩者的非鍵作用，圓圈部分為與黃腐酸產生非鍵作用的鈣調蛋白中的氨基酸，不同的顏色表示鍵的類型不同。由圖可知，有電荷間的吸引力、氫鍵、碳氫鍵、π-烷基鍵及π-σ鍵；圖6顯示的是黃腐酸與SOD對接后兩者的非鍵作用，由圖可知，有碳氫鍵、π-烷基鍵及π-S鍵。結合圖1和圖2可知，圖5和6中所提到的那些鍵大都與羰基、羥基、含氧環中的氧及苯環上的大π鍵有關，據此可以推斷，對于黃腐酸分子，不論是與生物大分子進行對接還是與其他有機物發生反應，主要都是與它所含的以上基團作用。

圖3 鈣調蛋白和黃腐酸對接示意圖Fig.3 Results of docking (the fulvic acid was combined with calmodulin)

圖4 SOD和黃腐酸對接示意圖Fig.4 Results of docking (the fulvic acid was combined with SOD)

圖5 黃腐酸與鈣調蛋白對接后兩者非鍵作用示意圖Fig.5 Non-bond interaction of fulvic acid-calmodulin compound

圖6 黃腐酸與SOD對接后兩者非鍵作用示意圖Fig.6 Non-bond interaction of fulvic acid-SOD compound

由圖7可知，隨著溫度的增加，體系的總能量總體來講是呈下降趨勢的，能量越低，物質本身便越穩定。而與此同時，對于鈣調蛋白來說，能量的降低也有利于它與其他物質的結合。通過軟件計算可知：非活性鈣調蛋白與Ca2+的結合能是-349.32 kcal/mol，與黃腐酸分子結合后再與Ca2+結合的結合能是-357.05 kcal/mol，可以看出結合能有所下降，由此可推斷黃腐酸可以促進非活性的鈣調蛋白向活性構象轉變，從而能夠促進生物體內與鈣調蛋白有關的生理活動的進行，如刺激SOD的生成，利于植物的生長,提高植物的抗逆性能。

圖7 黃腐酸-鈣調蛋白配合物的動力學模擬結果Fig.7 Results of dynamics simulation (fulvic acid was combined with calmodulin)

圖8為黃腐酸-SOD配合物進行動力學模擬后所得的結果。由圖可知，隨著溫度的增加，體系的總能量與開始相比最終也是呈下降趨勢的，這就說明配合物的構型也變得更加穩定了。通過軟件計算可知：未與黃腐酸分子對接前，SOD的能量為-3517.1514 kcal/mol，而與黃腐酸分子對接后SOD自身的的能量變為-3632.9798 kcal/mol，能量有所下降，但是下降的并不是十分明顯，因此還需通過接下來的計算來證明到底哪種作用機理更為合理。

圖8 黃腐酸-SOD配合物的動力學模擬結果Fig.8 Results of dynamics simulation (fulvic acid was combined with SOD)

2.2 大分子-大分子復合物和結果分析

圖9 SOD為受體,鈣調蛋白為配體進行分子對接結果示意圖Fig.9 SOD as a receptor, calmodulin as a ligand, the calmodulin was combined with SOD

圖10 已與黃腐酸對接的SOD為受體,鈣調蛋白為配體進行分子對接結果示意圖Fig.10 Fulvic acid- SOD compound as a receptor, calmodulin as a ligand, the calmodulin was combined with fulvic acid-SOD

圖11 SOD為受體,已與黃腐酸對接的鈣調蛋白為配體進行分子對接結果示意圖Fig.11 SOD as a receptor, fulvic acid-calmodulin compound as a ligand, the fulvic acid-calmodulin compound was combined with SOD

圖12 已與黃腐酸對接的SOD為受體，已與黃腐酸對接的鈣調蛋白為配體進行分子對接結果示意圖Fig.12 Fulvic acid-SOD compound as a receptor, fulvic acid-calmodulin compound as a ligand, the fulvic acid-calmodulin compound was combined with fulvic acid-SOD

比較黃腐酸-SOD配合物和黃腐酸-鈣調蛋白配合物的結合能，-106.69 kcal/mol和-357.05 kcal/mol，可看出后者比前者構象更加穩定，因此黃腐酸更易于與鈣調蛋白結合形成配合物。

由以上數據可知：黃腐酸促進植物體內SOD的形成最可能的途徑是：黃腐酸先與鈣調蛋白結合再與SOD作用，因為從能量的角度來看，這樣所需的能量最低，反應也更容易朝此方向進行。

3 結論

大田實驗結果顯示，黃腐酸能夠作為一種生物刺激素作用于植物，而且用黃腐酸培養液培育的植物，其細胞質中SOD的含量明顯增加，而這種酶的增多對于植物體內超氧自由基的清除又有很明顯的促進作用[13-15]，同時還可以增加植物的抗逆性。本論文計算機分子模擬的計算結果表明，黃腐酸促進植物體內SOD的形成最有可能的機理是：黃腐酸先與鈣調蛋白結合，形成較為穩定配合物，后再與SOD作用，降低了酶本身的能量，從而增強了其與其他物質作用時的親和力。與此同時，由于沿此途徑形成的酶的能量較低，因而也有利于刺激植物體內SOD的形成。

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A Preliminary Study on the Mechanism of Formation of Superoxide Dismutase Affected by Fulvic Acid

Zhang Caifeng1,2, Wu Yunbin1, Song Zhen1
(1 Taiyuan Normal University, Jinzhong, 030619 2 Humic Acid Engineering and Technology Research Center of Shanxi Province, Jinzhong, 030619)

A study on the formation mechanism of superoxide dismutase (SOD) was conducted. The result showed that the formation of superoxide dismutase in plant’s leaves was promoted by fulvic acid to some extent. The molecular simulation analysis indicated that fulvic acid could reduce the binding energy between the calmodulin and Ca2+to make calmodulin becoming easier to be activated.

humic acid; fulvic acid; calmodulin; superoxide dismutase(SOD)

TQ314.1，Q554

1671-9212(2017)03-0056-06

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.03.006

國家自然科學基金(批準號：51174275)、山西省留學歸國基金資助(No.2011085)和太原師范學院大學生創新項目(CXCY1606)資助。

2017-5-25

張彩鳳，女，1964年生，教授，主要從事腐植酸生物功能方面研究，E-mail：841322483@qq.com。