兩種無孔強陽離子交換色譜固定相的制備及色譜性能比較

卜春苗，龔波林

（1.寧夏大學化學化工學院，寧夏銀川750021；2.北方民族大學，寧夏銀川750021）

兩種無孔強陽離子交換色譜固定相的制備及色譜性能比較

卜春苗1，龔波林2

（1.寧夏大學化學化工學院，寧夏銀川750021；2.北方民族大學，寧夏銀川750021）

針對基質表面的化學修飾是分離材料性能的直接決定因素。本文對3.0 μm無孔單分散親水性交聯聚甲基丙烯酸環氧丙酯樹脂（PGMA/EDMA）進行不同的化學方法改性，制備得到兩種強陽離子交換色譜填料（SCX-I和SCX-II），并對填料表面的磺酸基含量進行測定。在相同的色譜條件下，詳細考察了這兩種填料對堿性蛋白的分離性能，親水性能考察，以及對溶菌酶的動力學吸附容量。SCX-I和SCX-II填料的各項性能對比結果表明，SCX-I填料上磺酸基鍵合量高，分離堿性蛋白具有較好的選擇性，親水性好，能夠用于對雞蛋清中溶菌酶的快速分離純化。

無孔單分散親水性聚合物微球；強陽離子交換色譜；對比；蛋白分離

Key words：non-porous monodiperse polymer beads；strong cation-exchange stationary phase；comparison；protein separation

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）已成為發展生命科學，材料科學和環境科學等重要學科研究必不可少的手段和工具[1，2]。色譜固定相是HPLC系統的核心，也是分離科學研究的重要課題[3]。目前離子交換色譜固定相在活性生物大分子的分離和純化中被廣泛應用，但一般要分離的目標產物常處于稀的水溶液或發酵液中，易使蛋白質失活和構型發生變化，因此減少分離和純化時間以保持蛋白的生物活性是非常必要的[4]，無孔類型的快速離子交換色譜固定相應運而生。與多孔填料相比，其最主要的特點是，被分離的生物大分子只在表面進行傳質交換，消除了停滯流動相傳質帶來的峰加寬，故可用于蛋白質和多肽等生物大分子的快速分離分析[5]。

相關離子交換色譜固定相的報道較多，但大多為硅膠基質，大大限制了固定相在分離中的pH應用范圍。本文采用自制的3.0 μm無孔單分散親水性的交聯聚甲基丙烯酸環氧丙酯（PGMA/EDMA）樹脂[6]，同時解決多孔填料分離純化時間長和硅膠pH應用范圍窄的弊端。另外，對基質進行表面修飾是提高固定相分離性能和選擇性的決定因素，這也是研究者都致力于開發新型制備方法和合成路線用于提高分離材料色譜性能的主要原因。基于以上原因，開發兩種改性方法，對（PGMA/EDMA）樹脂進行修飾用于制備強陽離子交換色譜（SCX）固定相，詳細研究不同合成方法對離子交換色譜性能的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

（1）儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1100），CGY－100型高壓氣動泵，2003型電動攪拌器，超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

（2）試劑：肌紅蛋白（Myo，馬心）；核糖核酸酶（RNase-A，牛紅細胞）；α-糜蛋白酶原-A（α-Chy-A，牛胰臟）；細胞色素-C（Cyt-C，馬心）；溶菌酶（Lys）均購自美國Sigma公司。

1.2 強陽離子交換填料的合成

1.2.1 SCX-I型填料的合成100 mL三頸瓶中加入4.0 g水解PGMA/EDMA樹脂（II）,再加入一定量的二氧六環和三氟化硼乙醚后,超聲分散5 min，在攪拌下滴加一定量環氧氯丙烷，80℃恒溫水浴反應2.5 h，產物依次用水和丙酮洗滌后真空干燥。再取樹脂（III）3.0 g加入到250 mL的單口燒瓶中，加入16 mL無水乙醇和一定量NaHSO3水溶液，超聲分散5 min，90℃水浴反應24 h。產物用水反復洗滌。抽濾，干燥，得SCX-I型填料。合成反應（其中P代表聚合物）（見圖1）。

1.2.2 SCX-II型填料的合成將3.0 g無孔PGMA/EDMA（I）樹脂加入一定量的稀鹽酸中，在30℃水浴中反應2.5 h。產物用水，乙醇，丙酮反復洗滌數次，真空干燥，即得微球（II）。再加入一定量NaHSO3水溶液，超生分散后80℃水浴中反應24 h，再用水，乙醇和丙酮反復洗滌即得到強陽離子交換色譜填料（SCX-Ⅱ）。合成路線（見圖2）。

1.3 色譜填料的裝填

將自制的SCX-I和SCX-II填料，以蒸餾水為勻漿液和頂替液，在30 MPa壓力下以勻漿法裝柱，不銹鋼柱管：5.0×0.46 cm I.D。

圖1 SCX-I型填料合成路線

圖2 SCX-II型填料的合成路線

1.4 磺酸基含量的測定

按照文獻[7]報道的方法測定填料表面磺酸基的含量。

1.5 動態吸附容量測定

動態吸附容量的測定采用迎頭分析法[8]，含有2 mg/mL Lys的PBS的緩沖溶液測定其穿透曲線，根據下式計算動態吸附容量：

式中：q5-達到5%穿透時的動態吸附容量（mg/mL）；c-入口Lys的濃度；F-Lys的體積流速（mL/min）；t5-出口濃度達到5%的保留時間（min）；t0-死時間（min）；V-柱體積（mL）。

1.6 應用研究

雞蛋清樣品的處理：取新鮮的蛋清液20 mL，向其中加入80 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），超聲15 min后加入一定量的NaCl使其濃度為1.0 mol/L，離心除去雜質，得到的上清液用所制備的SCX柱進一步分離純化溶菌酶。

2 結果及討論

2.1 SCX填料的合成及評價

同苯乙烯微球相比，PGMA/EDMA微球表面的疏水性弱，但此微球制備時以聚苯乙烯（PSt）為種子，采用一步溶脹聚合法得到，其疏水性主要來源于碳氫主鏈和抽提不完全的PSt種子，所以將該樹脂作為生物大分子的分離材料，對其進行表面親水性改性是非常必要的。本實驗中，設計合成兩種改性方法用于制備SCX填料。SCX-I填料制備（見圖1），首先將PGMA/EDMA微球水解為具有一定親水性的鄰二醇，再進一步與環氧氯丙烷反應，后與含有氯的樹脂與NaHSO3反應得到帶有磺酸基的陽離子填料。改性方法大大增加了PGMA/EDMA樹脂表面的親水性，測定其磺酸基含量為0.37 mmol/g。SCXII填料的改性方法相對簡單（見圖2），將PGMA/EDMA微球先與稀鹽酸反應，后與NaHSO3反應即可得到，此方法簡單，但其親水性不如SCX-I填料，測定其磺酸基含量僅為0.19 mmol/g。

2.2 SCX柱對標準蛋白的分離性能

標準蛋白在兩種SCX柱上的分離圖（見圖3）。

圖3 標準蛋白在兩種SCX柱上的分離圖

2.3 SCX填料表面親水性能考察

無孔PGMA/EDMA樹脂的疏水性主要源于聚合物的碳氫主鏈，因此，應對改性后的SCX-I和SCX-II填料表面的親水性進行考察。采用在流動相中加入5%（v/v）的異丙醇（IPA）溶液，與不加入IPA時的結果相比較（見表1）。

表1 SCX-I和SCX-II柱上未加IPA和加5%IPA對蛋白保留的影響

從表1中可以看出，加入異丙醇后四種蛋白在SCX-I和SCX-II柱的保留時間都有不同程度地減小，但SCX-I柱減小量較小。實驗結果進一步表明SCX-I柱上僅存在弱的疏水性，蛋白質的保留行為主要取決于與固定相之間的靜電相互作用，這也說明了SCX-I柱的改性方法優良，增強了固定相表面的親水性，大大抑制了蛋白與微球間的非特異性吸附。

2.4SCX填料動力學吸附容量的測定

動態吸附曲線能夠為分離介質的動力學鍵合量提供有價值的信息。在本工作中，分別測定了SCX-I和SCX-II柱對溶菌酶（Lys）的動力學吸附容量，測試流動相組成為20 mmol/LPBS+1.0 mol/LNaCl+0.5 mg/mLLys，流速為0.5 mL/min條件下獲得的前沿突破曲線。根據公式（1）得到SCX-I和SCX-II的動力學吸附容量分別為：20.5 mg/g和15.6 mg/g。磺酸基含量較高的SCX-I柱具有較高的吸附容量，進一步表明，SCX-I填料的改性方法更適用于分離純化堿性蛋白。

圖4 雞蛋清樣品中溶菌酶與標準樣品中溶菌酶對比

2.5 SCX柱應用于分離純化雞蛋清中溶菌酶

目前，離子交換色譜是制備高純度溶菌酶最常用的方法。本文采用合成的SCX-I柱對所處理的雞蛋清樣品進行分離，與標準溶菌酶樣品進行對照（見圖4），在2 mL/min的流速下，6 min內可對雞蛋清中的Lys進行快速分離純化。圖4中的第一個峰為雜蛋白，標*的峰為Lys。由圖4可以看出，Lys與其他雜蛋白得到了較好的分離，收集Lys組分，測定其純度大于92%。這表明所合成的無孔SCX-Ⅰ柱具有較高的選擇性，具備實際分離純化能力。

3 結論

本文主要針對不同的表面修飾方法直接決定分離材料的色譜行為。以3.0 μm無孔單分散親水性交聯聚甲基丙烯酸環氧丙酯樹脂為基質，采用兩種不同改性方法，制備得到兩種強陽離子交換色譜填料：SCX-I和SCX-II，首先測定SCX填料表面的磺酸基鍵合量，結果顯示SCX-I填料上的磺酸基含量大大高于SCX-II。進一步驗證兩柱的色譜行為，結果顯示，SCX-I柱對堿性蛋白的分離表現出更好的選擇性，具有優良的親水性能和較高的動態吸附容量，最后應用于雞蛋清中溶菌酶的分離純化中取得了滿意的效果。

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Preparation of two types of non-porous strong cation-exchange stationary phases and comparison with their performance

BO Chunmiao1，GONG Bolin2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan Ningxia 750021，China；2.Beifang University of Nationalities，Yinchuan Ningxia 750021，China）

The chemical modification on the surface of substrate is the critical factor on the performance of separation material.In this work,two kinds of strong cation-exchange（SCXI and SCX-II）stationary phases have been synthesized by the different chemical modification of the 3.0 μm non-porous monodiperse poly（glycidymethacrylate-co-ethylenedimethacrylate）（PGMA/EDMA）resin,and determined the percent of sulfonate groups on the two prepared SCX materials.Under the same chromatographic conditions,the performance for the separation of basic proteins,hydrophilicity,dynamicn loading capacity of the two SCX columns were investigated in detail.In comparison with the performance of SCX-I and SCX-II packings,the results indicated that the higher bonded content of sulfonate groups,the better selectivity on the separation of basic proteins and hydrophilicity were all achieved on SCX-I stationary phase.Finally,the application in rapid separation and purification of Lys from egg white by SCX-I column obtained satisfactory results.

O657.75

A

1673-5285（2017）06-0137-04

10.3969/j.issn.1673-5285.2017.06.030

2017－05-12

卜春苗，女（1980-），中級，碩士，主要從事色譜固定相的制備及應用研究的工作。