豬流行性腹瀉病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero細胞的傳代適應性研究

藍日國，張書晴，張金秋，苗晉鋒，通信作者

（1. 南京農業大學 動物醫學院，南京 210095；2. 江蘇省農業科學院 國家獸醫疫苗工程技術研究中心，南京 210014）

豬流行性腹瀉病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero細胞的傳代適應性研究

藍日國1，張書晴1，張金秋2，苗晉鋒1，通信作者

（1. 南京農業大學 動物醫學院，南京 210095；2. 江蘇省農業科學院 國家獸醫疫苗工程技術研究中心，南京 210014）

為了解PEDV YL112株與其他不同來源PEDV毒株之間在分子生物學上的差異，對PEDV YL112株的M基因進行了擴增和序列分析。結果表明：PEDV YL112株與參考株的M基因核苷酸同源性在97.9%～99.8%之間，顯示出高度保守性。系統進化樹分析表明，PEDV YL112株與經典株CV777的親緣關系較遠，而與我國地方流行毒株HLJBY分離株以及HN-XYYYP-2007的親緣關系較近。為進一步了解該毒株的復制特征，采用Vero 細胞對PEDV YL112株進行體外細胞傳代適應性研究。結果表明：經過連續傳代培養后，PEDV YL112株對Vero細胞的適應性顯著增強，其滴度從第5代的 104.8TCID50/0.1mL 提高至第 40 代的 107.6TCID50/0.1mL。本研究對于分析PEDV的遺傳變異規律、了解病毒的致病特征及開發新型疫苗等均具有重要理論和現實意義。

PEDV YL112株；M基因；序列分析；Vero細胞；適應性

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和仔豬的高死亡率為特征[1-2]。各個階段的豬群都會發病，尤其是10日齡以內的仔豬，死亡率高達100%。近年來，PED在我國呈高發趨勢，給養豬業造成了巨大的經濟損失[3-4]。

PEDV屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coraonavirus），是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 knt，主要編碼纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、囊膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）等[5]。其中 M蛋白在病毒的組裝和出芽過程中起著關鍵的作用，它不僅與E蛋白一起完成病毒囊膜的組裝過程，還可以指導S蛋白[6-7]和核衣殼[8]形成具有出芽能力的病毒顆粒。機體在M蛋白刺激下會產生免疫保護作用，誘導機體產生IFN-α和調控病毒的表達。因此，M蛋白可用于研制PEDV的基因工程疫苗[9-11]。

雖然PEDV只有一個血清型，但各毒株的基因組之間卻存在差異[12]。近年來，對我國流行的PEDV毒株出現變異的報道不斷增多[13-14]。本研究采用生物信息學軟件對PEDV YL112株的M基因進行分析，并與GenBank登錄的PEDV參考序列進行核苷酸同源性比較，然后構建系統進化樹，以闡明PEDV YL112株的M基因與參考毒株的M基因之間在分子生物學水平上的差異，并采用Vero細胞對PEDV YL112株進行體外適應性培養，為今后開展 PEDV的流行病學研究、病原學研究及疫苗的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞

PEDV YL112株由廣西麗原生物股份有限公司于2009年11月至2010年3月期間，分離自廣西玉林市某疑似感染PEDV的豬場。Vero細胞由廣西麗原生物股份有限公司研發部提供，經檢測無外源病毒或支原體污染。

1.2 試劑

胰酶、胎牛血清、DMEM細胞培養基均購自Gibco公司；病毒核酸提取試劑盒（TaKaRaMini BESTViralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0）、反轉錄試劑盒【PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）】均購自寶生物（大連）工程有限公司；PCR酶FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）（Cat.No.04 913 850 001）購自Roche公司；無水乙醇、瓊脂糖、DL2000 DNAMarker等購自南京壽德試驗器材有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。

1.3 引物

根據GenBank報告的PEDV M 基因序列（登錄號 DQ072726），利用 Oligo6.0軟件設計引物，用于擴增PEDV的全長M 基因（854 bp），引物序列如下：

上游引物P1：5′-ACACCTATAGGGCGCCTG TA-3′；

下游引物P2：5′-AACCCTAAGAGGGGCATA GA-3′。

引物由上海英駿生物工程有限公司合成。

1.4 PEDV YL112株 M基因的擴增

取200 μL細胞毒，用TaKaRa核酸提取試劑盒提取病毒RNA，溶于30 μL的RNase Free dH2O中，置于-80 ℃保存備用。然后按照TaKaRa反轉錄試劑盒使用說明書進行反轉錄。反應條件：37 ℃作用15 min，85 ℃作用5 s，暫存4 ℃，完成后將反轉錄產物于-20 ℃保存備用。下一步進行M基因的PCR擴增，在25 μL反應體系中加入1 μL反轉錄產物，相應的上、下游引物各10 pmol，Mix12.5 μL，滅菌三蒸水補足25 μL。反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃1 min，33個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物（擴增長度 854 bp）于 2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，凝膠成像系統下觀察PCR擴增結果后，按照Axygen公司的凝膠回收試劑盒說明回收PCR產物后，送往上海華大基因測序。

1.5 PEDV YL112株M基因遺傳進化分析

用DNAStar軟件將PEDV YL112株M基因測序結果與GenBank登錄的PEDV不同毒株的M基因序列進行核苷酸同源性分析，并應用生物信息學軟件MEGA 7. 0繪制系統發育樹（NJ方法，比對值為1 000次重復）。參考毒株見表1。

表1 PEDV參考毒株

1.6 Vero細胞染色體的制備及核型分析

將Vero細胞用含10% FBS的DMEM進行常規培養，顯微鏡觀察細胞的形態學特征，并記錄每代Vero細胞長成致密的單層所需的時間。向處于對數生長期的Vero細胞中加入適量的秋水仙素使其終濃度為0.1 μg/mL，繼續培養5～6 h后，消化、離心并棄上清。于離心管中加入7 mL 0.075 mol/L的氯化鉀溶液，低滲處理細胞30 min后，向其中加入少量新鮮配制的固定液（V甲醇:V冰醋酸＝3:1），輕輕混勻后置于37 ℃水浴10 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清。沿管壁緩慢加入上述固定液8 mL，輕輕混勻后于37 ℃水浴20 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清，重復該步驟3次。第3次棄上清后于離心管中加入0.5 mL固定液，輕輕重懸細胞。用該細胞懸液向已預冷的載玻片上滴片（2～3滴/片），姬姆薩染液染色5～10 min后，用細水沖去多余染料。于油鏡下觀察細胞染色體核型，并記錄其染色體的數量。

1.7 PEDV YL112株的體外細胞適應性傳代

將 PEDV YL112毒株用含 10 μg/mL胰酶的DMEM作10-4稀釋，接種于正常生長的Vero細胞，每瓶1 mL，37 ℃、5% CO2條件下吸附1 h后，每個小方瓶補充4 mL含有10 μg/mL胰酶的DMEM維持液繼續培養2～3 d，待細胞80%出現病變時收獲病毒，放置于-70 ℃保存，得第1代毒。同樣方法，將上述第1代毒在Vero細胞上進行細胞適應性傳代。收集各代次病毒，-70 ℃保存備用。

1.8 毒價測定

將常規培養的Vero細胞接種于96孔細胞培養板中，待細胞達到90%融合度時，棄去培養液，并用無菌PBS清洗細胞兩遍。然后將PEDV YL112病毒按 10倍比稀釋法用維持液（含有 10 μg/mL胰酶的DMEM）進行梯度稀釋，10-1～10-8每個稀釋度分別接種于96孔板中的Vero細胞，每個稀釋度接種5孔，每孔100 μL，并設置5孔細胞對照。37 ℃、5% CO2條件下吸附1 h后，加入維持液至200 μL，置于CO2培養箱中37 ℃繼續培養。逐日觀察，記錄結果。從原代起，每隔5代進行一次病毒含量測定。按Reed-Muench法計算TCID50。

2 結果

2.1 PEDV YL112株細胞毒M基因的擴增

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果出現長度約850 bp的特異性條帶，與預期結果一致（圖1）。

圖1 PEDV YL112株M基因PCR擴增結果

2.2 PEDV YL112株M基因的遺傳進化分析

測序結果顯示，PEDV YL112株M基因序列長度為854 bp，無插入或缺失。運用DNAStar軟件將該序列與GenBank登錄的PEDV不同毒株的M基因進行核苷酸同源性分析，結果發現 PEDV YL112株與各參考株的 M基因核苷酸同源性在97.9%～99.8%之間。用Mega5.0繪制M基因系統進化樹如圖2所示。

圖2 PEDV YL112株M基因系統進化樹

分析發現，包括PEDV YL112株在內的21株PEDV毒株明顯分成了兩個群，其中一群是以經典毒株CV777為代表的早期流行毒株，2010年前分離的所有參考毒株均屬于該群；另外一群均為2010年以后出現的中國地方流行毒株。從進化樹中可以看出，PEDV YL112株是早期流行毒株群成員之一，但其在群內與經典毒株CV777的親緣關系較遠，而與我國地方流行毒株 HLJBY以及HN-XYYYP-2007的親緣關系較近（圖2）。

2.3 Vero細胞染色體特征及數目

仔細觀察吉姆薩染色后的Vero細胞染色體標本，發現本試驗所用的Vero細胞染色體數目眾多，且大小差異較大（圖3）。在顯微鏡下記錄一個完整細胞的染色體數目，約為 59～60條，即 2n＝59～60，與預期結果一致。

圖3 Vero細胞核型分析（100×）

2.4 PEDV YL112株的體外細胞傳代適應性

由毒價測定結果可知（表2），隨著 PEDV YL112株連續傳代次數增加，病毒滴度也逐漸提高，從第5代的 104.8TCID50/0.1mL 提高至第35代的107.6TCID50/0.1mL。繼續傳代至40代，病毒滴度基本穩定在較高水平（107.6TCID50/0.1mL），沒有進一步的顯著提升。

表2 PEDV YL112株各代次毒價測定情況

3 討論

PEDV疫苗很早就應用于豬流行性腹瀉的防控，但該病依舊在免疫豬群發生。尤其是2010年以來，我國多個省份相繼出現PED的爆發，導致大量新生仔豬發病死亡，嚴重影響了我國養豬業的發展。該病的再次流行引起了人們的廣泛關注。

2009年11月至2010年3月期間，廣西玉林市某豬場疑似感染PEDV。本研究首先對分離于該地區的PEDV YL112株進行了M基因的核苷酸同源性分析，發現該毒株與各參考毒株M基因之間的核苷酸同源性在97.9%～99.8%之間，顯示出M基因在PEDV毒株進化過程中具有高度的保守性。系統進化樹分析表明，PEDV YL112株與經典疫苗株CV777的親緣關系較遠，而與我國地方流行毒株HLJBY及HN-XYYYP-2007的親緣關系較近。從時間維度來看，2010年以前中國流行的PEDV毒株大都與經典毒株CV777相似性較高，而2010年以來，PEDV中國流行毒株開始出現變異現象[15]，PEDV YL112株正好處于過渡階段，與系統進化樹分析結果一致（圖2）。該結果表明廣西地區當時出現的流行株與早期使用的疫苗株相比已發生變異，這與臨床上常規疫苗免疫預防效果差的現象相符[16]。這也提示要進一步加強對PEDV的分子流行病學調查和病原生態學研究，為制定合理的免疫預防策略提供及時有效的數據參考。

PEDV的體外細胞適應一直是制約病原研究及疫苗開發的瓶頸。目前，普遍認為添加了胰酶的Vero細胞可以用于PEDV的分離培養[17-18]。為進一步了解PEDV YL112株的復制特征，本研究采用Vero 細胞對該毒株進行體外適應性傳代。試驗用于培養病毒的Vero細胞形態正常，生長狀況良好，細胞核型正確，符合病毒培養的需要。通過對病毒連續傳代，發現隨著代次的增加，病毒的滴度也逐漸提高，最后達到了107.6TCID50/0.1mL，并且維持在較高水平，表明該毒株高度適應了Vero細胞培養。這對于進一步了解該毒株的致病性、免疫原性及后續的疫苗研究均具有重要的現實意義。

本研究對PEDV YL112株進行了M基因的擴增和序列分析，對該毒株在PEDV國內流行毒株遺傳進化上的地位有了初步的認識。同時，將PEDV YL112株在Vero細胞上進行傳代培養，使毒株高度適應了 Vero細胞，成功獲得高滴度的PEDV細胞毒株，為下一步進行 PEDV的致病性研究及疫苗開發提供了試驗依據。

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責任編輯：宗淑萍

Sequence Analysis of the M gene of Porcine Epidemic Diarrhea VirusYL112 Strain and Its Adaptation to Vero Cells

LAN Ri-guo1, ZHANG Shu-qing1, ZHANG Jin-qiu2, MIAO Jin-feng1,CorrespondingAuthor
(1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2.National Research Center for Veterinary Vaccine Engineering and Technology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

To analyze the genetic variation between PEDV YL112 strain and other isolates, the M gene of PEDV YL112 strain was amplified and sequenced. The M gene of PEDV YL112 strain shared 97.9%-99.8% homology with PEDV reference strains.Phylogenetic analysis indicated that PEDV YL112 strain was genetically close to isolates HLJBY and HN-XYYYP-2007 rather than the classic strain CV777. Furthermore, adaptation of PEDV YL112 to Vero cells was conducted and its titer significantly increased from 104.8TCID50/0.1mL to 107.6TCID50/0.1mL by cellular adaptation. These results may contribute to further study on the genetic evolution, viral virulence and new vaccines of PEDV.

PEDV YL112; M gene; sequence analysis; Vero cells; adaptation

S858.28

：A

2017-03-29

國家自然科學基金項目“線粒體MAVS 蛋白在抗H3N2亞型豬流感病毒感染過程中的作用”（31201873）；國家自然科學基金項目“肌醇磷脂-Ca2+-NFAT途徑在?；撬峋徑馊榉挎溓蚓腥局械淖饔谩保?1672515）

藍日國（1993-），男，廣西梧州人，本科在讀，主要從事動物健康調控的研究。

苗晉鋒（1976-），男，河南新鄉人，副教授，博士，主要從事動物健康調控的研究。E-mail：mjf171647@126.com。

1008-5394（2017）02-0034-05