人喉鱗狀細胞癌中CMIP的表達及意義

韋黨軍，高潮兵，吳正升

人喉鱗狀細胞癌中CMIP的表達及意義

韋黨軍1,2，高潮兵3，吳正升1

目的 探討CMIP(C-Maf inducing protein)基因在人喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)和喉息肉組織中的表達及其臨床意義。方法 應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測28例人LSCC和23例喉息肉組織中CMIP mRNA的表達；應(yīng)用免疫組化法檢測86例人LSCC和29例喉息肉組織中CMIP蛋白的表達，分析其與LSCC臨床病理特征及其預后的關(guān)系。結(jié)果 LSCC CMIP mRNA和蛋白表達均顯著高于喉息肉組織；CMIP表達與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈顯著正相關(guān)，并且CMIP表達均與LSCC患者無復發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)密切相關(guān)。結(jié)論 CMIP可能參與人LSCC的發(fā)生、發(fā)展，CMIP表達提高可能是LSCC進展和預后不良的潛在標志物。

喉腫瘤；鱗狀細胞癌；CMIP；實時熒光定量PCR；免疫組織化學

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是人喉部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌，是呼吸系統(tǒng)第二大惡性腫瘤[1]。盡管近年來LSCC的診療技術(shù)有了一定進展，中晚期LSCC患者的預后仍然不令人滿意[2]。另外，一些傳統(tǒng)的判定LSCC患者預后的指標，如臨床TNM分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標并不能完全準確的評估患者的生存狀況和指導后續(xù)治療[3]。因此，探討人LSCC發(fā)生、發(fā)展背后的分子機制以及相關(guān)重要調(diào)控因子，有助于發(fā)掘并建立新的有效的判定LSCC患者病情進展和預后生物學標志物，乃至將來對LSCC的分子靶向藥物的研發(fā)具有重要意義。本文分別使用實時熒光定量PCR和免疫組化法檢測LSCC患者新鮮腫瘤組織和石蠟包埋組織(以喉息肉作為對照)中CMIP(C-Maf inducing protein)的表達及其與患者臨床病理特征及預后的關(guān)系，探討CMIP作為LSCC病情進展和患者預后判定的一種新的生物學標志物。目前，關(guān)于CMIP在人LSCC的研究國內(nèi)外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009～2012年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和太和縣中醫(yī)院病理科存檔的86例LSCC和29例喉息肉組織，組織均以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。每例病例診斷均經(jīng)病理證實。按照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)最新分期標準進行臨床分期。所有病例均獲隨訪，獲得無復發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)。患者術(shù)前均未接受任何放療或化療等治療。另收集2015～2016年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院存檔的耳鼻喉手術(shù)切除的28例LSCC和23例喉息肉組織，標本離體后立即置入液氮保存。所有病例診斷均經(jīng)病理證實。

1.2 試劑與方法

1.2.1 實時熒光定量PCR Trizol提取液購自Reagent公司，cDNA合成試劑盒購于Takara公司，Ex Tap PCR反應(yīng)試劑盒購于Takara公司，PCR引物由上海捷瑞公司合成。首先將收集的LSCC和喉息肉新鮮組織按照試劑說明書進行總RNA提取，cDNA合成和定量PCR檢測。每個樣本分別重復3次，得到擴增曲線和樣本的相對定量Ct值。以標本CMIP的Ct值和內(nèi)部參照GAPDH的Ct值用2-△△Ct法得到每個樣本CMIP的mRNA相對表達水平。

1.2.2 免疫組化 鼠抗人CMIP單克隆抗體購自Proteintech公司(工作濃度1 ∶100)，采用免疫組化MaxVision法染色，即用型免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新公司，具體操作按說明書染色步驟進行。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 CMIP染色以細胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色顆粒視為陽性著色，染色標準綜合陽性細胞率及染色強度進行評估，判斷表達強度：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(1+)，3～4分為中度陽性(2+)，5～6分為強陽性(3+)。陰性和弱陽性視為低表達，中度和強陽性視為高表達。

2 結(jié)果

2.1 CMIP在人LSCC和喉息肉組織中的表達 在新鮮樣本中，28例LSCC的CMIP mRNA表達量為3.05±1.25，23例喉息肉組織為1.44±0.52，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1)。而CMIP蛋白陽性信號呈黃色顆粒狀，主要定位于鱗狀細胞癌的細胞質(zhì)，正常鱗狀上皮有少量表達(圖2)。86例石蠟包埋LSCC組織中CMIP高表達率為52.3%，29例喉息肉組織高表達率為27.6%，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

圖1 喉息肉和喉鱗狀細胞癌組織中CMIP mRNA的表達

表1 CMIP在人喉鱗狀細胞癌和喉息肉中的表達[n(%)]

*P=0.021

AB

圖2 CMIP蛋白在喉息肉組織(A)中呈低表達，在喉鱗狀細胞癌組織(B)中呈高表達，MaxVision法

2.2 CMIP表達與LSCC臨床病理特征的關(guān)系 CMIP表達與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈顯著正相關(guān)(P<0.05；P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤位置和組織學分級均無顯著相關(guān)性(P>0.01，表2)。

表2 CMIP表達與人喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 CMIP表達與LSCC患者預后的關(guān)系 為探討CMIP表達與LSCC患者預后的關(guān)系，本實驗采用Kaplan-Meier曲線法和Log-rank檢驗對CMIP蛋白表達及LSCC患者RFS和OS關(guān)系進行單因素生存分析。86例具有完整隨訪資料的LSCC患者，CMIP蛋白表達均與患者RFS和OS密切相關(guān)(P均<0.01，圖3)。

圖3 喉鱗狀細胞癌組織中CMIP蛋白表達與患者無復發(fā)生存率(A)和總生存率(B)的關(guān)系

3 討論

喉癌是臨床耳鼻咽喉頭頸外科常見的腫瘤之一，好發(fā)于中老年男性，其具體病因尚不十分清楚，可能與患者吸煙、病毒感染和飲酒過多等多種因素有關(guān)。近年來，隨著我國城市大建設(shè)和城鎮(zhèn)工業(yè)化的影響，大氣污染如霧霾等日益加重，可能也是引起喉癌發(fā)病率升高的原因之一[4-6]。目前，臨床喉癌的治療主要采取以手術(shù)治療為主的綜合治療，包括手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療等。然而，每種治療均有其優(yōu)缺點，對于喉癌患者特別是中晚期患者的治療效果難以達到滿意的效果。近年來，隨著“個體化治療”和“精準治療”等理念的提出，迫切需要開發(fā)新的有效的腫瘤生物標志物和藥物靶點為不同患者提供最合適的治療策略[7-8]。因此，認識腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等分子機制，從中發(fā)掘重要的調(diào)控因子對監(jiān)測腫瘤病情發(fā)展、指導治療和建立藥物靶點有著重要意義。

LSCC是臨床實踐中喉癌最主要的組織學類型，目前大多數(shù)喉癌研究均以其為研究對象，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些LSCC相關(guān)的癌基因和抑癌基因。Gao等[9]采用免疫組化法檢測76例LSCC和26例喉息肉組織中ARTN基因及其受體GFRα1表達，發(fā)現(xiàn)LSCC中ARTN和GFRα1表達顯著高于喉息肉組織，并且與腫瘤臨床分期和患者預后密切相關(guān)。Zhuang等[10]研究發(fā)現(xiàn)LSCC組織中CCAT1表達顯著高于癌旁組織黏膜組織，并且與腫瘤組織學分級和臨床分期密切相關(guān)，進一步體外研究發(fā)現(xiàn)，高表達CCAT1能夠促進LSCC細胞Hep-2的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，提示CCAT1可能在LSCC發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因角色。孫玉滿等[11]應(yīng)用免疫組化SP法檢測85例LSCC及癌旁切緣組織中p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白表達，發(fā)現(xiàn)p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白在LSCC發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，癌旁切緣組織中p53、p21和Cdk1/p34cdc2過表達與LSCC局部復發(fā)密切相關(guān)，Ge等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-300在LSCC組織中表達較癌旁正常組織顯著下調(diào)，并且過表達miR-300可以顯著抑制Hep-2細胞的增殖和侵襲，提示miR-300在LSCC進展中發(fā)揮抑癌基因角色。

CMIP是一種銜接蛋白，具有兩種亞型：一種亞型是短蛋白，參與多種信號通路，并且在微小病變型腎小球腎炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[13-14]；另一種亞型是長蛋白，其功能目前尚不清楚[15-16]。CMIP在人LSCC中角色尚未見報道。本實驗首先使用兩種技術(shù)檢測LSCC組織和良性喉息肉組織中CMIP蛋白和mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織中CMIP蛋白和mRNA表達均較良性病變組織顯著提高。進一步通過臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，CMIP表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)，并且與LSCC患者RFS和OS呈負相關(guān)，提示CMIP在LSCC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮癌基因角色。

綜上所述，本實驗通過檢測臨床LSCC組織和喉息肉組織樣本中CMIP的表達，發(fā)現(xiàn)CMIP表達量與患者病情進展和術(shù)后生存期密切相關(guān)，提示CMIP可能參與LSCC發(fā)生、發(fā)展，其表達量可能是預測病情進展和患者預后的生物學指標。

[1] Jemal A, Bray F, Center M M,etal. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] Luke C G, Yeoh E, Roder D M. Exploring trends in laryngeal cancer incidence, mortality and survival: implications for research and cancer control[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2008,9(3):397-402.

[3] Tang X B, Shen X H, Li L,etal. SOX2 overexpression correlates with poor prognosis in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Auris Nasus Larynx, 2013,40(5):481-486.

[4] Marur S, Forastiere A A. Head and neck squamous cell carcinoma: update on epidemiology, diagnosis, and treatment[J]. Mayo Clin Proc, 2016,91(3):386-396.

[5] Hedberg M L, Goh G, Chiosea S I,etal. Genetic landscape of metastatic and recurrent head and neck squamous cell carcinoma[J]. J Clin Invest, 2016,126(4):1606.

[6] Zibelman M, Mehra R. Overview of current treatment options and investigational targeted therapies for locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Am J Clin Oncol, 2016,39(4):396-406.

[7] Mena E, Thippsandra S, Yanamadala A,etal. Molecular imaging and precision medicine in head and neck cancer[J]. PET Clin, 2016,12(1):7-25.

[8] Parsel S M, Grandis J R, Thomas S M. Nucleic acid targeting: towards personalized therapy for head and neck cancer[J]. Oncogene, 2016,35(25):3217-3226.

[9] Gao C, Cheng X, Li X,etal. Prognostic significance of artemin and GFRα1 expression in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Exp Ther Med, 2014,8(3):818-822.

[10] Zhuang K, Wu Q, Jiang S,etal. CCAT1 promotes laryngeal squamous cell carcinoma cell proliferation and invasion[J]. Am J Transl Res, 2016,8(10):4338-4345.

[11] 孫玉滿, 劉宏俠, 楊俊泉, 等. 細胞周期依賴性蛋白激酶1(Cdk1/p34cdc2)對喉癌術(shù)后局部復發(fā)的預測價值[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(3):293-298.

[12] Ge W, Han C, Wang J,etal. MiR-300 suppresses laryngeal squamous cell carcinoma proliferation and metastasis by targeting ROS1[J]. Am J Transl Res, 2016,8(9):3903-3911.

[13] Liu Y, Su L, Lin Q,etal. Induction of C-Mip by IL-17 Plays an important role in adriamycin-induced podocyte damage[J]. Cell Physiol Biochem, 2015,36(4):1274-1290.

[14] Ory V, Fan Q, Hamdaoui N,etal. C-mip down-regulates NF-kappaB activity and promotes apoptosis in podocytes[J]. Am J Pathol, 2012,180(6):2284-2292.

[15] Audard V, Zhang S Y, Copie-Bergman C,etal. Occurrence of minimal change nephrotic syndrome in classical hodgkin lymphoma is closely related to the induction of c-mip in Hodgkin-Reed Sternberg cells and podocytes[J]. Blood, 2010,115(18):3756-3762.

[16] Grimbert P, Valanciute A, Audard V,etal. Truncation of C-mip (Tc-mip), a new proximal signaling protein, induces c-maf Th2 transcription factor and cytoskeleton reorganization[J]. J Exp Med, 2003,198(5):797-807.

Clinical significance of CMIP expression in human laryngeal squamous cell carcinoma

WEI Dang-jun1,2, GAO Chao-bing3, WU Zheng-sheng1
(1DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,TaiheHospitalofTraditionalChineseMedicine,Fuyang236600,China;3DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the expression of C-Maf inducing protein(CMIP) in human laryngeal squamous cell carcinoma and polyps tissues, and to analyze their association with clinicopathological parameters and survival of patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Methods Real-time PCR assay was used to detect the expression of CMIP mRNA in 28 cases of laryngeal squamous cell carcinoma and 23 cases of polyp fresh tissue specimen. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CMIP in 86 cases of formalin-fixed and parrffin-embedded laryngeal squamous cell carcinoma and 29 cases of polyp tissue specimens. The clinicopathological and prognostic significance of CMIP expression was investigated in laryngeal squamous cell carcinoma. Results The expression of CMIP mRNA and protein was both significantly increased in laryngeal squamous cell carcinoma compared with polyp tissue specimens. The expression of CMIP was significantly associated with tumor lymph node metastasis and late clinical stage of laryngeal squamous cell carcinoma. Furthermore, the expression of CMIP was significantly correlated with poor relapse-free survival and overall survival in laryngeal squamous cell carcinoma. Conclusion CMIP might play an important role in the development and progression of laryngeal squamous cell carcinoma and increased expression of CMIP might imply disease progression and poor outcome in patient with laryngeal squamous cell carcinoma.

laryngeal neoplasms; squamous cell carcinoma; C-Maf inducing protein; Real-time PCR; immunohistochemistry

安徽省學術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選科研基金資助項目(2016H074)、安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016046)

1安徽醫(yī)科大學病理學教研室，合肥 2300322安徽省阜陽市太和縣中醫(yī)院耳鼻喉科，阜陽 2366003安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，合肥 230032

韋黨軍，男，碩士研究生。Tel: (0551)62922025，E-mail: 13966591297@163.com 吳正升，男，博士，教授，通訊作者。E-mail: woozson@126.com

時間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.012.html

R 739.6

A

1001-7399(2017)06-0649-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.012

接受日期：2017-02-14