口服pCDNA3.1+/Ag85ADNA疫苗在小鼠腸道的表達

徐佳+劉瀅+于淼

[摘要] 目的 分析口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道局部的表達情況。方法 用脂質體包裹pCDNA3.1+/Ag85A DNA質粒制成口服疫苗。對照組雌性C57BL/6小鼠5只用生理鹽水灌胃，實驗組雌性C57BL/6小鼠5只用脂質體包裹的Ag85A DNA疫苗灌胃。共免疫3次，每次間隔14 d。免疫結束后14 d處死小鼠，取小腸組織固定于4%多聚甲醛中備用。采用免疫熒光和免疫組化方法檢測兩組小鼠小腸派氏淋巴結、派氏淋巴結內的樹突狀細胞和小腸黏膜上皮細胞中Ag85A的表達情況。結果 在實驗組小鼠的小腸黏膜上皮細胞、派氏淋巴結以及派氏淋巴結內的樹突狀細胞中均檢測到重組pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗的表達，而且不同部位的小腸黏膜上皮細胞中Ag85A的表達強度不同，靠近固有層的小腸黏膜上皮細胞內Ag85A的表達強度比靠近腸腔側的小腸黏膜上皮細胞高（P<0.05）。在對照組小鼠上述部位無重組DNA疫苗的表達。結論 脂質體包裹的口服DNA疫苗能夠被小鼠腸道吸收，同時可誘導特異性黏膜免疫反應。

[關鍵詞]Ag85A；DNA疫苗；脂質體；上皮細胞；樹突狀細胞；小鼠

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（c）-0004-04

[Abstract]Objective To analyze the expression of oral pCDNA3.1+/Ag85A DNA vaccine in the intestinal tract of mice.Methods Oral vaccine was made using liposomes to parcel pCDNA3.1+/Ag85A DNA plasmid.5 female C57BL/6 mice in control group were given saline water for gavage while 5 female C57BL/6 mice in experimental group were given liposome encapsulated Ag85A DNA vaccine for gavage.The mice were immunized three times with 14 days interval between each time.In the fourteenth day after immunization，cervical dislocation executed in mice and the small intestine was fixed with 4% paraformaldehyde to be prepared to detect the expression of Ag85A in the intestinal Peyer patches，the dendritic cells in Peyer patches and intestinal epithelial cells with immunofluorescence and immunohistochemistry methods.Results Oral vaccine pCDNA3.1+/Ag85A DNA was expressed in intestinal Peyer patches，the dendritic cells in Peyer patches and the intestinal epithelial cells of mice in the experimental group，and in different parts of the intestinal epithelial cells in mice of the experimental group，the expression intensity of Ag85A was different.The expression intensity of Ag85A was higher near the lamina propria than near the lumen of intestinal epithelial cells （P<0.05）.It was not expressed in above parts of mice in the control group.Conclusion Oral DNA vaccine parceled with liposomes can be absorbed by intestinal tract of mice and induce specific mucosal immune response.

[Key words]Ag85A；DNA vaccine；Liposomes；Epithelial cells；Dendritic cells；Mice

Ag85A是結核分枝桿菌的一種外分泌蛋白，能夠刺激機體產生特異性免疫應答，包括體液免疫應答和細胞免疫應答。卡介苗（BCG）也包含編碼Ag85A的基因。研究表明，裸DNA疫苗經肌內注射后，其目的基因表達在肌細胞內而且能夠誘導機體產生免疫應答[1-2]，該裸DNA疫苗經肌內注射后主要引起Th1免疫應答，而經基因槍注射后主要引起Th2免疫應答，同時相應的抗體產生水平升高[3-4]。然而，目前還沒有口服DNA疫苗在消化道局部表達的報道。本實驗通過檢測口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗的基因表達產物在C57BL/6小鼠腸道局部的表達，為臨床經口服用DNA疫苗提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

脂質體包裹的口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗為中國醫科大學免疫學教研室制備，其中的LipofectamineTM 2000購于Invitrogen公司；6～8周齡的雌性C57BL/6小鼠由中科院上海實驗動物中心提供，合格證號：中科動管第005號；無內毒素超純質粒DNA提取、純化試劑盒購于Promega公司；Jackson ImmunoResearch Laboratories提供Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG；Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c購于BD Pharmingen公司；FITC-goat-anti-chicken IgY和HRP-goat-anti-chicken IgY二抗購于Gene公司；chicken anti-Ag85A IgY一抗購于Prosci公司；DAB顯色試劑盒和牛血清蛋白（BSA）購自北京中杉公司。

1.2疫苗制備

將Ag85A基因序列全長擴增，經測序、同源性分析后，插入pCDNA3.1+真核表達載體，經鑒定正確后轉化入DH5α擴增，無內毒試劑盒提取、純化質粒pCDNA3.1+/Ag85A，灌胃前將脂質體LipofectamineTM 2000與質粒充分混勻，4℃靜置20 min，待脂質體充分包裹后制成口服DNA疫苗[5]。

1.3動物分組及免疫

將10只雌性6～8周齡的C57BL/6小鼠隨機分成兩組，免疫前2 h禁食水。用7.5% NaHCO3和Hank液按1∶4比例混合制備胃酸中和液，每只鼠灌胃300 μl胃酸中和液中和胃酸，30 min后灌胃免疫。實驗組小鼠灌胃100 μg脂質體包裹的重組pCDNA3.1+/Ag85A質粒DNA疫苗，對照組小鼠灌胃等量的生理鹽水。每組小鼠免疫3次，每次間隔14 d[6]。

1.4免疫組化技術檢測小鼠腸道局部Ag85A的表達

在口服疫苗免疫結束后14 d處死小鼠，PBS沖洗小腸組織，將含有派氏淋巴結的小腸組織置入4%多聚甲醛備用。標本經梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，進行石蠟包埋、切片。標本經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，加3% H2O2封閉10 min。抗原修復后用5% BSA封閉。chicken anti-Ag85A IgY（1∶400） 4℃過夜后再用HRP-goat-anti-chicken IgY（1∶200）37℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木精染色、0.5%～1%鹽酸乙醇分化后，再經梯度乙醇脫水和二甲苯透明。抗體孵育、染色等操作后均用PBS洗3次，5 min/次。中性樹膠封片后用普通光學顯微鏡觀察Ag85A在小鼠腸黏膜上皮細胞、派氏淋巴結和派氏淋巴結內樹突狀細胞中的表達。

1.5免疫熒光技術檢測小鼠腸道局部Ag85A的表達

將4%多聚甲醛固定24 h后的小鼠小腸組織置于30%蔗糖溶液中4℃過夜，待組織標本沉至蔗糖溶液底部后取出，OTC包埋，冰凍切片，厚度約5 μm。晾干后的標本分別用3% H2O2和5% BSA 37℃封閉30 min后，同時加chicken anti-Ag85A IgY一抗（1∶400）和Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c（1∶20）一抗4℃過夜，FITC-goat-anti-chicken IgY二抗（1∶200）和Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG（1∶75）同時37℃避光孵育30 min，甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察Ag85A在小鼠腸黏膜上皮細胞、派氏淋巴結和派氏淋巴結內樹突狀細胞中的表達情況。

1.6統計學分析

用SPSS 18.0統計學軟件對計量資料進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組小鼠小腸黏膜上皮細胞及派氏淋巴結中Ag85A表達的比較

免疫組化和免疫熒光結果顯示，實驗組小鼠小腸黏膜上皮細胞和派氏淋巴結中均有Ag85A廣泛表達，而對照組小鼠上述部位無Ag85A表達。在實驗組小鼠不同部位的小腸黏膜上皮細胞中，Ag85A的表達強度不同。在相同平均光密度和平均灰度值的條件下，靠近固有層的小腸黏膜上皮細胞內Ag85A的平均積分光密度為17.4416±5.5412，總平均灰度值為15 167.1800±326.8648，而靠近腸腔側的小腸黏膜上皮細胞內Ag85A的平均積分光密度為7.4114±1.8510（t=3.750，P=0.020），總平均灰度值為7165.3120±158.6779（t=53.369，P=0.000），表明靠近固有層的小腸黏膜上皮細胞中Ag85A的表達強度比靠近腸腔側的小腸黏膜上皮細胞高，差異有統計學意義（圖1、2）。

2.2 Ag85A在兩組小鼠小腸派氏淋巴結內樹突狀細胞中表達的比較

免疫熒光結果顯示，Ag85A在實驗組小鼠小腸派氏淋巴結內的樹突狀細胞中也有表達，但表達的細胞數量較少，而在對照組小鼠上述部位無表達（圖3）。

3討論

研究表明，DNA疫苗可以用于治療感染、腫瘤和超敏反應以及器官移植[7]，而口服疫苗是一種被廣泛接受的給藥方法，具有許多優點[8]。腸道是接觸抗原物質最多的器官，因此被認為是人體最大的免疫器官。腸道相關淋巴組織，包括腸系膜淋巴結和派氏淋巴結，通常被認為是發生免疫反應的主要場所，而發揮免疫效應的細胞則遍布于腸黏膜內[9-10]。盡管正常個體可能會在腸道甚至在血清中對這些無害性抗原產生低水平的抗體反應[11]，但是在生理環境中活躍的T細胞反應通常不會發生。在某些病理條件下，上述免疫反應可導致腸絞痛和克羅恩病等腸道疾病的發生[12-13]。腸道對無害性抗原的免疫低反應狀態被稱為口服耐受。口服耐受在維護機體正常生理功能中發揮重要作用，但也對口服疫苗的有效性提供了一個艱巨的挑戰。

M細胞被認為是腸道內最有效的將抗原從腸腔轉運到腸道相關淋巴組織的細胞[14]，是黏膜疫苗作用的關鍵，也是很多病毒和細菌侵入機體致病的關鍵[15-16]。研究表明，M 細胞可以攝取經脂質體包裹的DNA 疫苗，從而啟動腸道黏膜免疫應答[5]。還有報道稱小腸黏膜內的樹突狀細胞也可以攝取抗原物質[17-18]。本研究在實驗組小鼠小腸派氏淋巴結內部分樹突狀細胞中觀察到了Ag85A DNA疫苗的表達，而在小腸黏膜內樹突狀細胞中未見疫苗編碼蛋白的表達。本實驗還發現，實驗組小鼠小腸黏膜上皮細胞和小腸內派氏淋巴結中均有Ag85A的表達。不同部位的小腸黏膜上皮細胞中Ag85A的表達強度不同，靠近固有層的小腸黏膜上皮細胞比靠近腸腔側的小腸黏膜上皮細胞高，其機制還有待進一步研究。

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（收稿日期：2017-01-23 本文編輯：許俊琴）