谷子脅迫誘導型啟動子SiRLK35P的分離及生物信息學分析

王一帆+潘教文+李臻+王慶國+李穎秀+管延安+劉煒

摘要：本研究以谷子 “豫谷1號”為材料，結合相關數據庫檢索，以谷子幼苗提取的基因組DNA為模板，經PCR特異擴增SiRLK35上游1 893 bp調控序列，命名為SiRLK35P。結合PLACE數據庫，對SiRLK35P進行生物信息學分析，并對其誘導表達情況進行了預測。結果顯示，SiRLK35P中含有ABRELATERD1（ACGT）、GCCCORE（GCCGCC）等多種順式作用元件，部分元件已知與不同逆境脅迫及應答相關，預測該啟動子可能參與谷子脅迫響應，調控下游基因在脅迫等逆境條件下的表達水平，從而對谷子在脅迫下的應答進行調控。該研究為定向改良谷子抗逆特性、培育谷子抗逆新品種提供了候選材料。

關鍵詞：谷子；啟動子；SiRLK35P；順式作用元件；抗逆；品種培育

中圖分類號：S515：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0007-05

Abstract Using Yugu 1 as material， a 1 893 bp upstream regulatory sequence of SiRLK35 gene， which named SiRLK35P， was identified by database searching， and was isolated by PCR amplification using genomic DNA of foxtail millet as template. Bioinformatics analysis of SiRLK35P was carried out with PLACE database， and its expression pattern was forecasted. The results showed that several cis-acting elements， such as ABRELATERD1 （ACGT） and GCCCORE （GCCGCC）， existed in SiRLK35P， and parts of them were known to be associated with stress responsive processes， which indicated that SiRLK35P might participate in stress response and regulate the expression levels of downstream genes under stress conditions. This research would provide a candidate material for stress resistance improvement and new variety breeding of foxtail millet.

Keywords Foxtail millet； Promoter； SiRLK35P； Cis-acting element； Stress resistance； Variety cultivation

啟動子是一段位于功能基因上游，能結合RNA聚合酶及其他轉錄因子，從而決定基因轉錄起始以及表達量的DNA序列。啟動子作為基因上游的調控序列，其中的順式作用元件在基因的轉錄及時空表達調控方面發揮重要作用[1]。對基因啟動子的研究，尤其對該序列中所包含的不同調控元件的解析，將有助于預測基因的表達調控模式，為進一步解析基因功能奠定基礎。

根據啟動子所包含的關鍵調控元件的種類及功能，結合其下游調控基因的生物特性，植物中啟動子通常可分為三類：組成型啟動子、組織特異性啟動子和脅迫誘導型啟動子[2]，但同時很多組織特異性啟動子和脅迫誘導型啟動子也包含組成型啟動子[3]。其中，脅迫誘導型啟動子可對逆境條件如干旱、高鹽等非生物脅迫或病蟲害等生物脅迫產生響應，從而對基因的轉錄及表達進行調控[4]。

谷子在我國北方種植廣泛，是我國傳統糧食作物兼戰略儲備作物。但在國際科學界，其遺傳學研究相對落后。2012年，谷子測序工作的完成[5]，為解析谷子基因功能及其調控機制提供了新的途徑。本項目組在前期研究中發現一個與谷子抗逆相關的類受體蛋白激酶基因SiRLK35[6]。本研究擬結合谷子數據庫檢索分離得到該基因啟動子，并通過啟動子區作用元件分析，明確該啟動子類型，以期為進一步解析SiRLK35基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究以谷子品種“豫谷1號”為材料。pEASY BLUNT試劑盒、TransStart FastPfu DNA Polymerase試劑盒、2×EasyTaq SuperMix均購于Transgen公司（山東濟南雨同生物科技有限公司）；薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于GENERAY Biotechnology；高純質粒小量制備試劑盒購于BioTeke公司（濟南承森貿易有限公司）；引物由上海英濰捷基公司合成；其余試劑為進口或國產分析純。

1.2 基因組DNA提取

將“豫谷1號” 培養3周至三葉期，取其幼苗，使用TPS法提取谷子基因組DNA。

1.3 啟動子SiRLK35P的分離

檢索國家谷子數據中心（http：//www.setariadb.cn/），得到SiRLK35基因起始密碼子上游1 893 bp序列，作為基因啟動子序列，命名為SiRLK35P。使用Primer Premier 5設計引物SiRLK35PS1：TGCTTGTGCGTCTGCGCCGTGTGA、SiRLK35PA1：AACGGTTTATTTGCTTGGAGTACCT。以谷子幼苗基因組DNA為模板，PCR反應體系為：基因組DNA 1 μL、引物SiRLK35PS1、SiRLK35PA1各0.5 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL、5×TransStart FastPfu Buffer 4 μL、dNTPs 2 μL，ddH2O補齊到20 μL。反應程序設置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57.5℃ 30 s，72℃ 2 min，34個循環；72℃ 10 min。

PCR產物經膠回收，與pEASY BLUNT載體連接，轉化大腸桿菌Trans5α感受態細胞，均勻涂布于含100 mg/L Amp抗性的LB平板， 37℃倒置培養過夜，經菌落PCR鑒定，挑取陽性的單克隆，提取質粒后送至山東省農業科學院生物技術研究中心測序室測序。

1.4 啟動子SiRLK35P中順式作用元件分析

利用PLACE數據庫（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對啟動子所含的順式作用元件進行分析[7]。

2 結果與分析

2.1 啟動子SiRLK35P的克隆

借助序列特異性引物，應用PCR擴增到一條大約2 000 bp的條帶，測序結果顯示條帶大小為1 893 bp，與預測片段大小一致（圖1）。

2.2 啟動子SiRLK35P順式作用元件分析

使用PLACE數據庫，對SiRLK35基因啟動子SiRLK35P中所包含的順式作用元件進行預測。結果如圖2，該啟動子中除含有組成型的、序列保守的基本調控元件CAAT BOX、TATA BOX及組織特異性的胚乳醇溶蛋白元件DOFCOREZM之外[8，9]，還含有多種與植物抗逆相關的順式作用元件。其中包括參與植物抗逆以及生長發育調節的W BOX元件5個，調控ABA響應的ABRELATERD1元件3個、DPBFCOREDCDC3元件1個，在調控茉莉酸誘導的基因表達中起重要作用的GCCCORE元件5個，受SA誘導的GT1CONSENSUS元件1個，與致病菌鹽誘導相關GT1GMSCAM4元件1個，以及赤霉素響應元件PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 2個， 與氧化反應相關的CURECORECR元件 6個（表1）。

3 討論與結論

誘導型啟動子是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，可以被外界信號誘導表達，從而啟動其對下游基因在轉錄水平上的調控。誘導型啟動子在各物種中都有發現且研究較多，但在谷子中的研究相對較少。rd29A啟動子是目前研究最廣泛的誘導型啟動子之一，楊春霞等[10]通過構建rd29A啟動子驅動GUS基因的植物表達載體轉化煙草，發現經脅迫處理后，GUS基因表達增強，說明脅迫環境可誘導rd29A啟動子活性；Xu等[11]通過構建含有PsPR10啟動子的載體轉入煙草，結果顯示，SA、ABA以及MeJA處理均可誘導其活性；李鵬麗等[12]通過對大豆中與衰老相關的類受體蛋白激酶基因rlpk2上游啟動子區域研究發現，該啟動子能夠在番茄愈傷組織生長中瞬時表達； Li等[13]從山葡萄葉片中發現在幾丁質酶基因VCH3的上游存在兩個SA順式作用元件，其表達受SA誘導；彭建令等[14]克隆了3個含有細菌誘導元件的啟動子PPP1、PPP2、PPP3，轉入煙草植株后均可受青枯菌誘導；姜驍等[15]通過構建NTORK1啟動子驅動的GUS基因表達載體，瞬時轉化煙草葉片，結果NTORK1啟動子可被低濃度的NAA和高濃度SA誘導表達。

本研究借助PLACE數據庫對啟動子SiRLK35P進行分析，結果顯示，該區域中含有大量參與脅迫響應、功能行使的順式作用元件，其中包括參與植物抗逆響應的W BOX，說明該啟動子可能對逆境產生響應，從而調控下游基因表達；另外還含有GA響應元件PYRIMIDINEBOXOSRA MY1A，調控ABA響應的ABRELATERD1元件、 DPBFCOREDCDC3元件，在調控茉莉酸誘導的基因表達中起重要作用的GCCCORE元件，受SA誘導的GT1CONSENSUS元件以及與致病菌鹽誘導相關GT1GMSCAM4元件，說明該啟動子可能受GA、ABA等多種激素誘導并調控下游基因表達。因此，啟動子SiRLK35P具有多重因子誘導的活性，其下游基因SiRLK35可能在谷子的脅迫及誘導響應中發揮重要作用。

以上結果顯示，啟動子SiRLK35P為脅迫誘導型啟動子，具有被多種脅迫誘導的活性，推測在植物受到干旱、鹽等脅迫時，SiRLK35P可以通過調控下游基因的轉錄和表達水平，從而使植物對逆境脅迫做出響應，減少脅迫對植物的傷害。目前，該啟動子下游調控基因SiRLK35的植物雙元表達載體已構建成功，擬借助基因工程技術獲得轉基因植株，從而對該基因的生物學功能及其在植物抗旱抗逆等方面的應用進行研究。

參 考 文 獻：

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