新城疫病毒SD強毒株全長cDNA克隆的構建及序列分析

袁小遠+楊金興+張玉霞+孟凱+王友令+艾武

摘要：將新城疫病毒SD強毒株的全基因組cDNA序列進行分段擴增，并將各個片段通過In-Fusion技術連于克隆載體pBR322上，獲得了SD毒株的全基因組cDNA克隆。通過分段PCR擴增鑒定及全長測序分析，結果表明，SD毒株的全基因組cDNA克隆構建成功，并且成功引入T7啟動子序列，全長基因組序列與親本毒氨基酸序列的一致性為99.9%。單個序列比對發現，全基因組cDNA克隆中有11處堿基突變，其中只有2處引起氨基酸序列發生改變；整個序列未出現基因的缺失、插入變化，因此全長氨基酸的位數未發生任何變化。SD毒株全長cDNA克隆的成功構建和序列分析為后續的反向遺傳操作奠定了關鍵的技術基礎。

關鍵詞：新城疫病毒；基因組全長cDNA；重組質粒；序列分析

中圖分類號：S852.65+9.5：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0012-04

Abstract The whole genomic cDNA sequence of SD virulent strain of Newcastle disease virus was amplified in sections， and each fragment was attached to the clone vector pBR322 by In-Fusion technology. The whole genomic cDNA clone was obtained. Through the fragmented-PCR amplification and sequencing analysis， the results showed that the whole genomic cDNA clone of SD virulent strain was successfully constructed and the T7 promoter sequence was successfully imported. The identity of amino acid sequence between the whole genomic cDNA clone and parent strain was 99.9%. Single sequence alignment showed that there were 11 base mutations in the whole genomic cDNA clone， and only 2 sites caused the change of amino acid sequence. However， because of no occurrence of deletion and insertion of genes in the whole sequence， the number of full-length amino acids had no change. The successful construction and sequence analysis of whole genomic cDNA clone of SD virulent strain laid the key technical foundations for future reverse genetic operation.

Keywords Newcastle disease virus； Whole genomic cDNA； Recombinant plasmid； Sequence analysis

新城疫（Newcastle disease，ND）是一種禽類的高度接觸性疾病，對全世界養禽業造成巨大經濟損失[1，2]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）基因組是單股負鏈不分節段的RNA，病毒基因組包括六個結構基因，基因組全長為15 186 bp（或15 192 bp）[3]。單獨的NDV RNA在細胞內不能夠進行轉錄和翻譯蛋白，需要核衣殼蛋白、磷蛋白和大分子蛋白組成核糖核蛋白復合物才能行使轉錄和翻譯的功能[4，5]。

反向遺傳操作技術是指將RNA病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在體外通過基因突變、基因插入、基因敲除、基因置換等方法人為構建新的具有感染性的病毒，來研究病毒的基因組結構、功能及和病毒宿主之間的相互作用等，也叫全長感染性cDNA克隆技術。這一技術解決了RNA病毒基因組難以操作的難題，同時為新型疫苗的研發提供了新的思路。目前，國內外已在NDV的反向遺傳方面做了許多工作，成功構建并拯救了多株NDV感染性克隆病毒[5-7]。構建全長基因組克隆是進行反向遺傳操作的關鍵技術步驟和核心決定因素。因此，本研究擬構建NDV病毒SD強毒株的基因組全長cDNA克隆，為NDV的反向遺傳技術研究提供必要的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NDV的SD強毒株由山東SPF雞研究中心分離鑒定保存，pBR322改良載體和感受態大腸桿菌HST08由山東SPF雞研究中心制備保存。Gflex DNA聚合酶及PCR產品、In-Fusion HD克隆試劑盒、限制性內切酶等購自寶生物工程（大連）有限公司，Simple RNA kit購自博日生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank中NDV的全基因組序列（No：KU342001）設計3對引物，用于擴增NDV全基因組cDNA（表1）。引物由華大基因公司合成，PAGE plus級別純化。

1.2.2 RNA的提取和反轉錄 病毒RNA的提取按照Simple RNA kit操作說明進行，最后用30 μL DEPC水溶解RNA。反轉錄RT按照文獻[8]的操作進行，cDNA產物-20℃保存。

1.2.3 cDNA的分段擴增 將病毒cDNA分三段進行擴增，依次連接于經ClaⅠ酶切的pBR322載體上。具體擴增示意圖見圖1。

（1）片段In-PCR1的擴增克隆。cDNA產物2 μL、2×Gflex PCR Buffer（Mg2+、dNTP plus）25 μL、Tks Gflex DNA Polymerase （1.25 U/μL） 1 μL、cDNA-1F和cDNA-1R（20 pmol/μL）各1 μL，加水補至50 μL。反應條件94℃ 1 min；98℃ 10 s、55℃ 15 s、68℃ 3 min，共進行32個循環；4℃保存。將擴增得到的In-PCR1產物純化后與經ClaⅠ酶切的 pBR322載體經In-Fusion HD體系進行連接，50℃作用15 min。取連接產物2 μL熱轉化至E. coli HST08 Premium Competent Cell中，涂布平板，37℃過夜培養，挑取單克隆，提取質粒PCR驗證，重組陽性質粒經測序后命名為SD-IN1。

（2）片段In-PCR2的擴增克隆。cDNA產物2 μL，cDNA-2F和cDNA-2R（20 pmol/μL）各1 μL，Tks Gflex聚合酶進行PCR反應。反應條件94℃ 1 min；98℃ 10 s，52℃ 15 s，68℃ 3 min，共進行32個循環；4℃保存。將擴增得到的In-PCR2產物純化后與經ClaⅠ酶切的上述SD-IN1質粒經In-Fusion HD體系進行連接、轉化、驗證，重組陽性質粒經測序命名為SD-IN2。

（3）全長cDNA的擴增克隆。cDNA產物2 μL，cDNA-3F和cDNA-3R（20 pmol/μL）各1 μL，Tks Gflex聚合酶進行PCR反應。反應條件94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 2 min，共進行32個循環；4℃保存。擴增得到的In-PCR3產物與經ClaⅠ酶切的上述SD-IN2質粒進行連接、轉化、克隆。

1.2.4 全長cDNA克隆的驗證和序列分析 挑取單克隆，提取質粒，用兩對引物IN-P1/P2和IN-F1/F2分別進行分段的PCR擴增驗證，經測序的陽性克隆命名為SD-IN3，即全長cDNA克隆質粒。全長序列進行拼接后利用DNAStar v6.13進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 分段PCR擴增結果

按照預期設計，分三段進行NDV病毒全長cDNA的擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得3個目的基因片段，其大小均與預期擴增大小相符，為4.0～5.8 kb（見圖2）。

2.2 全基因組cDNA克隆的PCR驗證

全長SD-IN3重組質粒用IN-P/F系列引物進行分段PCR擴增驗證，獲得2個基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示其大小均與預期相符，約5.0 kb（見圖3）。

2.3 全基因組cDNA序列的測定與分析

通過對全基因組cDNA序列的測定與拼接，得到的SD毒株基因組總長度為15 192 bp，符合NDV的“六堿基”原則。利用DNAStar軟件分析，發現6個開放閱讀框的起始區高度保守，構建的cDNA序列與親本毒的氨基酸序列一致性為99.9%。單個序列比對發現，全基因組cDNA克隆中有11處堿基突變，只有2處引起氨基酸序列發生改變；整個序列未出現基因的缺失、插入變化，因此全長氨基酸的數量亦未發生變化。構建的全基因組cDNA克隆可用于病毒的感染性拯救研究。

3 討論與結論

本研究采用的In-Fusion HD克隆技術可以將PCR產物直接克隆到任意載體中，無需引物酶切位點的設計、限制性內切酶處理或粘性末端平滑化。In-Fusion酶可以利用線性化載體末端和PCR產物末端的15個相同的堿基，實現高效、精確的克隆，大大減少了篩選正確克隆的工作量，最終獲得的克隆具有定向的插入片段且不含多余序列[9]。

NDV反向遺傳操作技術體系主要包括基因組全長cDNA的克隆以及NP、P和L蛋白輔助質粒的構建及共轉染到特定的細胞系中拯救病毒粒子和新生病毒特性的鑒定[7，10]。Peeters等采用表達T7 RNA聚合酶的重組禽痘病毒構建疫苗毒株La Sota的感染性分子克隆，對F0裂解位點進行改造，將F0裂解位點的氨基酸序列從GGRQOIL/L轉變為GGRQORR/F時，病毒的毒力顯著增強。這樣直接證明F蛋白是決定NDV毒力的主要原因，NDV F0蛋白裂解位點的變化可以顯著改變NDV的毒力，從而結束了對F蛋白和毒力關系的推測[11]。

近年來，應用反向遺傳學技術拯救RNA病毒是RNA病毒學研究的一個熱點。感染性克隆病毒通過基因的突變、缺失、替換等技術而產生基因改造的新病毒，這在病毒的生活周期、基因結構和功能、致病機理、新型疫苗構建和抗腫瘤作用等研究方面具有很好的應用前景。本研究成功構建了SD毒株全長cDNA的克隆，并且引入T7啟動子序列，為后續的反向遺傳平臺的建立奠定基礎。

參 考 文 獻：

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[2]Samour J. Newcastle disease in captive falcons in the Middle East： a review of clinical and pathologic findings[J]. Journal of Avian Medicine & Surgery， 2016， 28（1）：1-5.

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[9]Zhu B， Cai G， Hall E O， et al. In-fusion assembly： seamless engineering of multidomain fusion proteins， modular vectors， and mutations[J]. Biotechniques， 2007， 43（3）：354-359.

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[11]Peeters B P， de Leeuw O S， Koch G， et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA： evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J]. Journal of Virology， 1999， 73（6）：5001-5009.