不同環境因子對草履蟲種群生長的影響

王興達+曹英昆+霸婉玉+張奇+王小瑞+沈慶洲+張鐵

摘 要：為了研究不同環境因子對草履蟲種群生長的影響，培養出優質的草履蟲，分別在pH梯度為：6.0、65、7.0、7.5、8.0，光照梯度為：0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx條件下培養草履蟲，結果表明，小白菜培養液培養草履蟲的最適pH值為7.0，并且相比于弱酸性環境，草履蟲更適宜在弱堿性環境中生長。在光照為0 lx條件下，草履蟲數量在第4天時達到最大值4 073 ind/100 mL，在光照為500～1 500 lx條件下，隨著光照度的增加，草履蟲的種群數量也隨之增加。

關鍵詞：草履蟲；pH值；光照；種群密度

1 引言

1.1 研究背景

大草履蟲（Paramecium caudatum）屬原生動物門， 纖毛亞門， 纖毛綱，體長只有80～300 μm，由一個單細胞組成，是動物學教學常用的實驗材料，也是實驗生物學的重要材料[1]。它除了應激迅速外，還具有分布廣泛，繁殖速度快，結構簡單，便于采集培養以及觀察的特點，在細胞生物學、分子遺傳學、分子生物學、生物信息學、仿生學等研究領域得到了廣泛的應用， 同時也是環境保護科學用來進行環境監測和水質凈化的活性生物材料[2～3]。本文旨在探討pH值和光照對草履蟲種群密度的影響， 從而為實現在實驗室條件下，短時間內大量培養出純度高、性狀穩定的草履蟲，以及為草履蟲在水體環境監測中的應用提供理論依據。

1.2 研究進展

草履蟲是原生動物門的代表動物，對其采集、純化及培養方面的研究，隨著科研的進步，實驗條件及設備的改進而不斷發展?，F有研究結果表明，23～27 ℃時大草履蟲的分裂生殖最為旺盛，25 ℃為最適溫度，低于10 ℃時不利于草履蟲的繁殖[4]。當培養液酸性較強時（pH值為3.0和4.0），草履蟲均死亡，草履蟲僅能在弱酸性條件下正常生長，對酸的耐受范圍在pH值5.0～7.0。當pH值高于9.0時，草履蟲不能正常生長，草履蟲只能在弱堿性條件下正常生長，對堿的耐受范圍在pH值7.0～9.0。

2 材料及方法

2.1 實驗材料燒杯、量筒、0～50 μL移液槍、紗布和皮筋若干、漏斗、載玻片，光學顯微鏡、電子天平、pH計、照度計等；新鮮的小白菜、氫氧化鈉、濃鹽酸等。

2.2 草履蟲的采集和純化

草履蟲通常生活在水流速度不大，深度較淺的水溝、池塘和稻田中， 并且大多積聚在有機質豐富、光線充足的水面附近。當水溫在24～27 ℃時， 繁殖最旺盛， 數目最多。草履蟲的這些習性， 是確定采集地點和方法的重要依據[5]。采集時到附近的水溝、池塘邊， 選擇沒有污染的地方， 用清潔的大燒杯沿水面采集水樣， 這樣的水中往往含有許多草履蟲，并且在距根部 10 cm處剪下并拔出處于生長狀態的蘆葦，拔出時帶有少量的泥土， 將此蘆葦根部再剪成 2～3 cm小段放于燒杯中，注入清水，放在溫暖明亮處。一周以后， 用顯微鏡檢查可見許多草履蟲。

上述采集到的草履蟲，往往含有許多其它的小型生物以及雜質，要想獲得純度較高的草履蟲，就必須經過分離純化。具體采用微量分離法，即用50 μL移液槍吸取擴大培養后的培養液10 μL于干凈載玻片上，在4倍顯微鏡下鏡檢，如發現草履蟲及其它一些小型生物，將之轉吸到另一塊干凈載玻片上，加10 μL小白菜培養液（小白菜培養液制作過程見2.3）按照1∶1比例稀釋變成20 μL，用移液槍在同一塊載玻片上再將其分成2滴，每滴10 μL，然后鏡檢，將含有草履蟲的那一滴再加10 μL小白菜培養液再次按1∶1比例稀釋變成20 μL，如此重復稀釋3～5次后，直到在10倍鏡下鏡檢確認已無其他生物為止。最后，將只含有草履蟲的10 μL培養液吸入500 mL小白菜培養液中（在吸取時注意更換槍頭以免混入其它生物），放于25 ℃光照培養箱中純化培養1周，即可得到濃度較高的草履蟲。若除草履蟲外仍有較多其他生物及雜質，可重復用上述微量分離方法再次進行分離純化。

2.3 培養液的制備

本實驗主要采用小白菜培養液，取新鮮潔凈的小白菜，用剪刀剪碎，按照2 g小白菜搭配自來水1 000 mL的比例， 將小白菜和自來水放入燒杯中， 加熱煮沸10～15 min，停止加熱。待冷卻至室溫，先后用雙層紗布、濾紙各過濾一次，以免一些雜質混入培養液妨礙草履蟲的計數觀察。為了防止空氣中其它原生動物的包囊落入以及蚊蟲產卵， 燒杯口要用雙層紗布包好， 然后放置在溫暖明亮處進行細菌繁殖。經過24 h后，小白菜培養液即可用于接種使用。

2.4 接種

接種是指將擴大提純后的草履蟲轉移到培養液的過程。按照上述分離提純時所用的方法，接種時， 先將含有草履蟲的液滴吸到干凈的載玻片上，置于低倍顯微鏡下鏡檢， 如果發現液滴內只有草履蟲， 可用移液槍將草履蟲吸入到盛有小白菜培養液的250 mL小燒杯中進行繁殖。如果液滴內除了草履蟲還有其它小型生物，可按照1∶1比例重復稀釋3～5次后，直到液滴內只含有草履蟲，才可用于接種。

2.5 培養

2.5.1 不同pH梯度下的培養

取100 mL小白菜培養液于250 mL小燒杯中，按以下pH值梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 （用鹽酸和氫氧化鈉溶液調節培養液到相應pH值）， 配制5種培養液， 每種設3個重復組。在每瓶培養液中接種10個草履蟲， 瓶口上方加蓋雙層潔凈紗布，放在25 ℃的光照培養箱中培養，從第2天開始每隔24 h進行取樣計數，每次計數完成后調節培養液到相應的pH值。

2.5.2 不同光照度下的培養

取100 mL小白菜培養液于250 mL小燒杯中，設置光照梯度分別在0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx，每個光照設3個重復，每個重復接種10個草履蟲，瓶口上方加蓋雙層潔凈紗布，放入25 ℃的恒溫培養箱中培養，從第2天開始，每隔24 h進行取樣計數。

2.6 觀察計數

取樣時，先把小燒杯搖勻，然后隨機取9份樣液，每份樣液10 μL，滴在干凈的載玻片上，用顯微鏡觀察計數，即每次每組pH和光照條件下，同組3瓶各觀察9份樣液，共27份。當蟲體數量較多時，草履蟲的運動速度快，不便于計數觀察，可采用擦鏡紙纖維阻攔法，在一定程度上限制草履蟲的運動。擦鏡紙本身呈細密網絡狀， 質地薄而均勻，能很好地限制草履蟲的運動， 觀察效果極為理想。方法如下：把擦鏡紙剪成與蓋玻片等大（或略大于蓋玻片）的小方塊， 放在載玻片上， 然后將草履蟲培養液滴到擦鏡紙上（不可太多， 以培養液正好能濕潤擦鏡紙為宜）， 然后蓋上蓋玻片觀察[6]。鏡檢所有液滴內的蟲數， 把每一瓶內9滴培養液的蟲數相加即為90 μL的總數， 然后再計算出100 mL培養液中草履蟲的個數。

3 結果與分析

3.1 不同pH值對草履蟲種群密度的影響

pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的5組草履蟲的數量見表1、圖1，其中，pH7.0組草履蟲生長最好，在第3天種群數量達到最大值。第3天后，弱堿性條件下2個組（pH值分別為7.5和80）草履蟲的種群數量明顯高于弱酸性條件下2個組（pH值分別為6.0和6.5）。從第2天開始，5個組的草履蟲種群密度都在飛速上升，其中以pH值7.0組上升趨勢最快，第3天達到最大值5 555 ind/100 mL，由此可知草履蟲生長所需的最適pH值為7.0。5個組草履蟲基本上到第2～3天種群密度達到最大值，弱堿性條件下的2個組（pH值分別為7.5和8.0）在第2天開始種群增長速度要高于弱酸性條件下的2個組（pH值分別為6.0和6.5），并且在以后持續幾天內，數量變化趨勢相對平穩，由此可知，草履蟲更適于生長在中性及弱堿性的水體環境中。

通過方差分析可得 pH值為6.0與6.5組間草履蟲的種群密度差異不顯著（P>0.05），但與其它3組差異顯著（P<0.05）；pH值7.0、7.5、80組間差異不顯著（P>0.05），pH值7.0組增長最快。

3.2 不同光照度對草履蟲種群密度的影響

草履蟲體內不含有葉綠體，不能進行光合作用，目前沒有光照與草履蟲種群數量變化關系方面的相關研究。作者認為光照可能會在某一程度上影響草履蟲的晝夜活動規律以及營養攝食。本試驗中4種不同光照下各組草履蟲的具體統計數量及變化見表2、圖2。在光照為0 lx的條件下，草履蟲的長勢良好，從第2天開始草履蟲的種群密度快速上升，并在第5天時達到最大值5 184 ind/100 mL。與有光照條件的其它3個組比較，無光照條件下的草履蟲生長狀況良好，并在第5天達到所有組的最大值，可見，光照的有無并不是制約草履蟲生長繁殖的必要條件。在有光照的條件下， 1 500 lx組的草履蟲數量在第3天為1 581 ind/100 mL，低于其它兩組，但從第3天開始，草履蟲大量分裂生殖，到第4天達到最大值4 073 ind/100 mL，其后兩天均高于1 000 lx與500 lx 組。1 000 lx組與500 lx組相比無明顯差異，但在第4天兩組草履蟲數量都達到最大值2 962 ind/100 mL以后， 1 000 lx組草履蟲數量下降趨勢平穩，表明1 000 lx比500 lx更有利于草履蟲生長，在500～1 500 lx條件下，草履蟲的種群密度隨著光照的增強而增大。

通過方差分析可得，500 lx、1 000 lx和1 500 lx組間均無顯著性差異（P>0.05）；0 lx與1 500 lx組間無顯著性差異（P>0.05），但與其他三組差異顯著（P<0.05）。在弱光條件下（低于1 500lx），草履蟲的種群密度隨光照的增強而增大；0 lx與500 lx，1 000 lx，1 500 lx三組相比差異顯著（P<0.05），在無光條件（0 lx）下，草履蟲的長勢良好，最早達到最大生長密度。

4 討論

pH值對動植物的生長有很大影響。何新華、張秋平等人在研究pH值對南美白對蝦蝦苗成活率的影響時發現pH值對白對蝦蝦苗影響非常大。水體環境的pH值為7.0～9.0時，蝦苗的應激性較小，蝦苗的存活率較高，為蝦苗的適宜環境。在pH值為7.0以下及9.0以上時，蝦苗的應激性非常大，蝦苗不適應此環境[7]。不同動植物對pH值的耐受范圍存在差異。有的生物對pH值的適應范圍非常廣，有的相對較窄，只適宜生活在特定的酸堿度下。甘志凱、張燕[8]認為在相當大的pH范圍內（5.0～10.0）草履蟲均能正常生長， 由此可見草履蟲對酸堿的耐受范圍很大、耐受性較強， 能夠適應較為惡劣的生存環境；黃正一和蔣正揆[9]認為草履蟲適宜在微堿性環境中生長，與本實驗結果相近。本實驗的研究結果表明，草履蟲在pH值為7.0的條件下長勢最好，并且相對于弱酸性條件（pH 6.0～7.0），草履蟲更適宜在弱堿性條件（pH 7.0～8.0）下生長。

在水生動物生存的環境中，光是一個復雜的生態因子，它有多方面的生態作用，直接或間接地影響動物的趨光性、晝夜活動節律、群集活動、攝食以及生長發育等[10]。草履蟲在數量較少時有一定的趨光性，即吸一滴帶有草履蟲的培養液于載玻片上，草履蟲會趨于水滴向光的邊緣帶運動。草履蟲體內不含有葉綠體，不能進行光合作用。作者認為光照不是影響草履蟲種群生長的主要因素，但可能會在晝夜活動節律以及營養攝食等方面起到一些限制作用。所以作者設置4種光照條件，初步探索光照與草履蟲種群生長的關系。實驗結果表明，在光照為0 lx的條件下，草履蟲的長勢良好，在弱光條件下（低于1 500 lx），草履蟲的種群密度隨著光照的增強而增大。

參考文獻：

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[2] 楊春英，李娜.培養液及其濃度和pH值對草履蟲種群增長的影響[J].微生物學雜志，2007， 27（4）：70

[3] Michaela C Strüder-Kypke， André-Denis G Wright， Sergei Fokin， et al.Phylogenetic Relationships of the Genus Paramecium Infered from Small Subunit rRNA Gene Sequences[J] .Molecular Phylogenetics and Evolution， 2000 ， 14（1）：122-130

[4] 許人和.溫度對大草履蟲（Parameciu mcaudatum Ehrenb.）分裂生殖速率的影響[J].新鄉師范學院學報，1982（03）：111-115

[5] 龔軍輝.草履蟲的采集、培養和觀察方法[J].高等函授學報（自然科學版），2003， 16（1）：41-43

[6] 張葉軍.草履蟲培養和觀察實驗的改進[J].科技視界，2013，10：132

[7] 何新華，張秋平，潘娟.pH值對南美白對蝦蝦苗成活率的影響[J].河北漁業，2015，12（002）：06

[8] 甘志凱，張燕.實驗草履蟲對酸堿耐受限度的測定[J].江西化工，2009，04（001）：131-134

[9] 黃正一，蔣正揆.動物學實驗方法[M].上?？萍汲霭嫔?，1981：8-10

[10] 舒建英.淺議環境因子對水生動物的影響[J].寧夏農林科技.2009（06）：169-170

（收稿日期：2017-03-01；修回日期：2017-07-04）

Abstract：In order to study the influence of different environmental factors on the paramecium population growth， and provide a theoretical basis for the acquisition paramecium culture and environment monitoring， respectively， at pH gradient： 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， light gradient： 0 lx， 500 Training under lx， 1 000 lx， 1 500 lx paramecium condition， results showed that cabbage broth culture paramecium optimum pH of 7.0， as compared to the acidic environment， paramecium more suitable for growing in a weak alkaline environment . In the light of the conditions under 0 Lx， Paramecium quantity in 4 days to reach a maximum 4 073 ind/100 mL， in the 500～1 500 lx illu mination conditions， light intensity increases， the number of paramecium population also increases.

Key words：paramecium； pH； light；population density