高效液相色譜法同時測定膽胃平顆粒中柚皮苷和新橙皮苷含量

魏曉銳，徐金玲，劉艷霞

（河南省許昌市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河南許昌461000）

高效液相色譜法同時測定膽胃平顆粒中柚皮苷和新橙皮苷含量

魏曉銳，徐金玲，劉艷霞

（河南省許昌市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河南許昌461000）

目的建立測定膽胃平顆粒中柚皮苷和新橙皮苷含量的高效液相色譜法。方法色譜柱采用WondaSil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為乙腈－水（用磷酸調(diào)pH至3，20∶80），檢測波長為283 nm，流速為1.0mL／min，柱溫為30℃。結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷進(jìn)樣量在0.081 3～1.625 7 g和0.081 7～1.633 4 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r＝0.999 9，0.999 9)；平均回收率分別為100.46%和99.59%，RSD為1.71%和1.43%（n＝6）。結(jié)論該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為膽胃平顆粒中枳殼的質(zhì)量控制方法。

膽胃平顆粒；柚皮苷；新橙皮苷；高效液相色譜法

膽胃平顆粒為許昌市中醫(yī)院制劑室的中藥制劑，由枳殼、香附、砂仁、黃芩、萊菔子、山藥、木香等11味中藥材組方，具有疏肝理氣、健脾和胃、利膽祛濕、活血止痛之功效，用于治療兩脅脹滿、食欲不振、胃脘疼痛、黃疸尿赤、膽汁反流性胃炎[1－2]。原標(biāo)準(zhǔn)中只有薄層色譜鑒別，不能有效地控制該制劑的質(zhì)量。枳殼是膽胃平顆粒的主藥，主要成分為黃酮類化合物[3－4]、揮發(fā)油和生物堿，黃酮提取物中又以柚皮苷、新橙皮苷含量較高。為全面、客觀地評價該制劑質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，本研究中對枳殼中具有藥理作用的黃酮類化合物進(jìn)行了含量測定[5－6]，建立了同時測定膽胃平顆粒中柚皮苷和新橙皮苷含量的高效液相色譜(HPLC)法[7－8]。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；MSA225S－000－DU型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（批號為110722－201111），新橙皮苷對照品（批號為111857－201102），均購于中國食品藥品檢定研究院；膽胃平顆粒（批號為16041102，16071803，16101002），枳殼陰性樣品均由許昌市中醫(yī)院制劑室制備；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：WondaSil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－水（用磷酸調(diào)pH值至3，20∶80）；流速：1.0 m L／min；柱溫：30℃；檢測波長：283 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算不低于3 000。在此色譜條件下，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取柚皮苷對照品8.62 mg，新橙皮苷對照品8.20mg，精密稱定，加甲醇制成每1m L含柚皮苷81.286 6μg、新橙皮苷81.672 0μg的溶液，即得。

供試品溶液：取膽胃平顆粒細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置150m L具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m L，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）45min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：取陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果陰性對照品溶液色譜圖中，在與供試品溶液相同保留時間位置上無柚皮苷、新橙皮苷色譜峰，陰性無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液1，4，7，10，13，17，20μL，注入液相色譜儀，測定。分別以柚皮苷、新橙皮苷峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，柚皮苷Y＝1.816 3×106X＋1.637 7×104（r＝0.999 9），新橙皮苷Y＝1.927 3× 106X＋1.837 0×104（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，柚皮苷與新橙皮苷進(jìn)樣量在0.081 3～1.625 7μg和0.081 7～1.633 4μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。詳見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算柚皮苷、新橙皮苷的色譜峰面積RSD分別為0.86%和0.61%（n＝6），詳見表1，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取膽胃平顆粒細(xì)粉（批號為16071803），精密稱取5份，制備供試品溶液，平行測定，計(jì)算柚皮苷、新橙皮苷的色譜峰面積。結(jié)果的RSD分別為1.15%和1.39%（n＝5），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同批（批號為16071803）樣品，依法制備供試品溶液室溫放置，于0，2，4，6，8，10 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算供試品溶液中柚皮苷、新橙皮苷的峰面積。結(jié)果的RSD分別為1.09%，1.22%（n＝6），表明10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號為16071803）膽胃平顆粒細(xì)粉6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入已知濃度的對照品溶液，依法進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測定

取3批膽胃平顆粒，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，每份樣品測定3次，取平均值。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 波長選擇

采用紫外－可見分光光度計(jì)對柚皮苷、新橙皮苷對照品溶液于200～400 nm波長內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果于283 nm波長處柚皮苷、新橙皮苷有最大吸收，且溶劑和其他成分對柚皮苷、新橙皮苷在該波長處無干擾，故選用283 nm為測定波長。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 柚皮苷、新橙皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.2 提取溶劑選擇[9－10]

提取溶劑曾采用甲醇、乙醇、稀乙醇，結(jié)果甲醇為提取溶劑時，樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量較高，而且高效液相色譜峰中柚皮苷、新橙皮苷峰形較好，雜質(zhì)幾乎無干擾，故選用甲醇為提取溶劑。

3.3 提取方法選擇

曾考察加熱回流、超聲提取2種方法，結(jié)果加熱回流方法和超聲處理方法測得的含量相當(dāng)，但超聲處理方法簡便快捷，易于操作，故采用甲醇超聲提取。分別對提取30，45，60 min進(jìn)行含量測定，結(jié)果超聲處理30 min的含量略低于超聲45 min和60 min，且后兩者含量相當(dāng)，故以超聲處理45min為宜。

3.4 流動相選擇

采用不同比例的乙腈－水（用磷酸調(diào)pH至3）為流動相[11－12]，測定膽胃平顆粒中柚皮苷、新橙皮苷的含量。增大乙腈比例時，出峰時間提前，但柚皮苷與相鄰色譜峰分離度低；增大水的比例時，出峰時間推遲且峰形不好。故以乙腈－水（用磷酸調(diào)pH至3）20∶80的比例為流動相，分離效果為最好，時間適中，柚皮苷、新橙皮苷與相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

3.5 指標(biāo)成分選擇

文獻(xiàn)[13－16]中對枳殼中的橙皮苷進(jìn)行了含量研究，但在本研究中，橙皮苷含量較低，且橙皮苷峰相同保留時間位置上有干擾峰出現(xiàn)，因此未將橙皮苷作為研究對象，而對含量較高的柚皮苷、新橙皮苷進(jìn)行了含量研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高效液相色譜法同時測定膽胃平顆粒中柚皮苷、新橙皮苷的含量，方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可對膽胃平顆粒中枳殼的含量進(jìn)行質(zhì)量控制。

表3 3批樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量（mg／g，n＝3）

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Content Determ ination of Naringin and Neohesperidin in Danweiping G rains by HPLC

Wei Xiaorui,Xu Jinling,Liu Yanxia

(Xuchang Institute for Food and Drugs Control,Xuchang,Henan,China 461000)

Objective To establish an HPLC method for content determination of the naringin and neohesperidin in Danweiping Grains.M ethods The chromatographic system consisted of WondaSil C18column(250 mm×4.6 mm,5μm)with mobile phase of acetonitrilewater(adjusted pH to 3 with phosphoric acid,20∶80),the detection wavelength was 283 nm,the flow rate was 1.0 m L／min and the column temperature was 30℃.Resu lts The linear range of naringin and neohesperidin was 0.081 3－1.625 7μg(r＝0.999 9),0.081 7－1.633 4μg(r＝0.999 9),respectively.The average recoveries were 100.46%(RSD＝1.71%,n＝6)and 99.59%(RSD＝1.43%,n＝6).Conclusion The method is simple,accurate and reproducible,which is suitable to control the quality of Citrus Aurantium in Danweiping Grains.

Danweiping Grains;naringin;neohesperidin;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)11－0028－03

2017－01－05；

2017－02－06)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.11.009

魏曉銳（1980－），女，主管藥師，主要從事中藥質(zhì)量檢測和藥物分析工作，（電子信箱）11188129＠qq.com。