利用油菜秸稈固態發酵生產β-葡萄糖苷酶的工藝優化

汪洲，肖玲玲，馮玉枚，郭金玲，田毅紅，呂育財，龔大春

利用油菜秸稈固態發酵生產β-葡萄糖苷酶的工藝優化

汪洲1，肖玲玲2，馮玉枚1，郭金玲1，田毅紅1，呂育財1，*龔大春1

（1.三峽大學生物催化重點實驗室，湖北宜昌443002；2.湖北三峽職業技術學院，湖北宜昌443002）

通過對固態發酵條件的優化，提高黑曲霉固態發酵產β-葡萄糖苷酶的產量。首先，通過單因素試驗確定麩皮與油菜秸稈粉質量比、料液比、（NH4）2SO4添加量、接種量、營養液初始pH值、培養溫度、培養時間等因素對β-葡萄糖苷酶的影響，再利用三因素三水平正交試驗得到最佳工藝條件。結果表明，麩皮與油菜秸稈粉質量比6∶4，料液比1∶1.8，培養溫度25℃，（NH4）2SO4添加量3%，接種量5%，營養液初始pH值4.7，培養時間4 d；經優化后，固態發酵產酶平均酶活達127.4 U/g，比優化前提高了50%。

固態發酵；β-葡萄糖苷酶；油菜秸稈

0 引言

植物纖維素是地球上最豐富的可再生資源，我國每年農作物秸稈高達7×108t之多，有效利用農作物秸稈這巨大的可再生資源，將在人類的能源、糧食和環境等問題中起到重大的作用，在可持續發展戰略中占有重要的地位[1]。

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系中一種重要的水解酶，是高效利用廢棄物秸稈的關鍵酶之一[2]。β-葡萄糖苷酶的工業化生產目前主要有固體發酵法、深層液體發酵法。就發酵方法而言，液體深層發酵自動化程度高，容易控制，適合于大規模工業化生產[3-4]。但是，液體發酵纖維素酶的發酵培養基需要經過較為細致的加工，培養基中原料的允許濃度較低，致使產物濃度不能很高且產生大量的廢水。固態發酵雖機械化程度低、產品不穩定、重復性差、但其操作工序簡化、產物濃度高、節約能耗，沒有大量的廢水產生[5]。且固態發酵纖維素酶使用的原料不必經過復雜的加工，在發酵過程中，糖化和發酵過程同步進行，可使微生物保持自然界中的生長狀態，模擬自然的生長環境[6-7]。所以，以黑曲霉固態發酵秸稈為研究對象，采用自主發明的固態發酵試驗裝置，在單因素試驗的基礎上，利用響應面對固態發酵條件進行了優化，以期得到最佳的β-葡萄糖苷酶固態發酵工藝，提供工藝的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger），三峽大學生物催化宜昌市重點實驗室提供；水楊素，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

BPC-250F型恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司產品；UV-1100型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產品；XFLS-50MA型滅菌鍋，浙江新豐醫療器械有限公司產品；SW-CT-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；FW177型中草藥粉碎機。

1.2 培養基的配制

（1）種子培養基。由KH2PO40.5%，（NH4）2SO41%，MgSO4·7H2O 0.1%，葡萄糖6%配制而成。

（2）固體發酵培養基。①營養液：MgSO40.2%，（NH4）2SO42%，FeSO40.01%，KH2PO40.2%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.1%，Co2+0.01%，羧甲基纖維素鈉0.1%，吐溫80 0.2%，聚乙二醇4000 1%，聚乙二醇6000 0.14%；②固體培養基：麥麩與40目油菜秸稈粉質量比6∶4。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵方法

將活化的黑曲霉斜面種子，用無菌水沖洗，制成濃度為108個/mL的孢子懸浮液，按2%的接種量接入種子培養基，于28℃，200 r/min條件下培養48 h，然后按10%的接種量接入到固體發酵培養基上，于30℃，濕度90%條件下恒溫培養44 d。

1.3.2 粗酶液的制備

將發酵所得固體酶曲按1∶10的料液比用HAc-NaAc緩沖液浸泡，攪拌10min后，再浸泡2 h，紗布過濾，以轉速8 000 r/min離心，上清液即為粗酶液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活定義及測定方法

β-葡萄糖苷酶酶活力單位的定義：在50℃，pH值4.8的條件下，每1min從質量分數為1.0%的水楊苷溶液中釋放1μmoL還原糖所需的酶量為1個酶活力單位U。

β-葡萄糖苷酶酶活測定方法，采用纖維素酶制劑國家標準。

1.4 試驗設計

1.4.1 發酵條件單因素試驗

（1）麩皮與油菜秸稈粉質量比的確定。麩皮∶油菜秸稈粉質量比分別以1∶4，2∶3，3∶3，3∶2，4∶1，在相同條件下恒溫培養4 d，測定酶活。

（2）最佳料液比的確定。分別以1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的料液比，在相同條件下恒溫培養4 d，測定酶活。

（3）最佳（NH4）2SO4添加量的確定。培養基中（NH4）2SO4添加量分別以0.5%，0.8%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，在相同條件下恒溫培養4 d，測定酶活。

（4）最佳接種量的確定。分別以6%，8%，10%， 12%，14%的接種量，在相同條件下恒溫培養4 d，測定酶活。

（5）營養液最適初始pH值的確定。將營養液初始pH值分別調至3，4，5，6，7，在相同條件下恒溫培養4 d，測定酶活。

（6）最佳培養溫度的確定。培養溫度分別為25，30，35，40℃，在相同條件下恒溫培養4 d，測定酶活。

（7）最佳培養時間的確定。以相同培養基和相同接種量在相同條件下分別培養4，5，6，7 d，測定酶活。

1.4.2 正交試驗設計

確定β-葡萄糖苷酶主要影響因素，選取3個因素3個水平進行正交試驗。

β-葡萄糖苷酶主要影響因素與水平設計見表1，正交設計見表2。

表1 β-葡萄糖苷酶主要影響因素與水平設計

表2 正交設計

通過正交試驗進行方差分析，得出最優條件。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

不同麩皮與油菜秸稈粉質量比對酶活影響見圖1，不同料液比對酶活影響見圖2，不同營養液初始pH值對酶活影響見圖3，不同接種量對酶活影響見圖4，不同（NH4）2SO4添加量對酶活影響見圖5，不同培養溫度對酶活影響見圖6，不同培養時間對酶活影響見圖7。

按照1.4的方法，利用油菜秸稈對黑曲霉固態發酵產β-葡萄糖苷酶發酵條件中的麩皮與油菜秸稈粉質量比、料液比、（NH4）2SO4添加量、接種量、營養液初始pH值、培養溫度和培養時間的單因素試驗優化。經分析得，麩皮與油菜秸稈粉質量比6∶4，料液比1∶2，（NH4）2SO4添加量1%，接種量8%，營養液初始pH值4.0，培養溫度30℃和培養時間5 d，酶活為85 U/g。

圖1 不同麩皮與油菜秸稈粉質量比對酶活影響

圖2 不同料液比對酶活影響

圖3 不同營養液初始pH值對酶活影響

圖4 不同接種量對酶活影響

圖5 不同（NH4）2SO4添加量對酶活影響

2.2 正交試驗及分析

圖6 不同培養溫度對酶活影響

圖7 不同培養時間對酶活影響

通過單因素試驗分析發現，料液比、培養溫度、麩皮與油菜秸稈粉質量比對β-葡萄糖苷酶酶活的影響較大，在（NH4）2SO4添加量4%，接種量8%，營養液初始pH值4.7，培養時間5 d不變的條件下，選取如表2的試驗方案進行試驗。

正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果

由表3可知，麩皮與油菜秸稈粉質量比非常重要，為顯著影響因素。從均值可以看出，料液比1∶1.8，培養溫度25℃，麩皮與油菜秸稈粉質量比6∶4，發酵得到的β-葡萄糖苷酶酶活最高。

2.3 驗證試驗

通過以上試驗得出的黑曲霉固態發酵生產β-葡萄糖苷酶的最佳培養條件為麩皮與油菜秸稈粉質量比6∶4，料液比1∶1.8，培養溫度25℃，（NH4）2SO4

添加量3%，接種量5%，營養液初始pH值4.7，培養時間4 d。做5組平行試驗，得到的酶活結果，試驗值與預測值接近，表明試驗設計可行。

驗證試驗見表4。

表4 驗證試驗

3 結論

在單因素所得結果的基礎上，進行正交試驗設計。從7個因素中篩選出3個主要影響因素，即麩皮與油菜秸稈粉質量比、料液比、培養溫度。通過正交試驗得出最佳培養條件為麩皮與油菜秸稈粉質量比6∶4，料液比1∶1.8，培養溫度25℃，（NH4）2SO4添加量3%，接種量5%，營養液初始pH值4.7，培養時間4 d。優化后，固態發酵所產酶的平均酶活達127.4 U/g，提高了50%。由此可見，試驗為油菜秸稈資源化利用提供了重要基礎。

[1]孫世榮，郭祎，岳金權.我國稻草資源化利用現狀及其評價[J].農業與技術，2015（17）：20-23.

[2]龔大春，馮玉枚，郭金玲，等.一種基于循環水溫度控制的固態發酵裝置：中國湖北，CN204676083U[P]. 2015-09-30.

[3]閆玉玲，袁敬緯，李杰，等.纖維素酶的制備工藝及其商業化現狀研究[J].當代化工，2015（5）：988-990，994.

[4]賴玉城.產多酶體系混菌固態發酵酒糟生產蛋白飼料[D].福建：福建師范大學，2014.

[5]張輝，張文會，孫中強.響應面法優化黑曲霉HQ-1產β-葡萄糖苷酶的固體發酵條件[J].食品研究與開發，2012，33（11）：188-192.

[6]葛龍，趙艷，章亭洲.固態發酵技術的特點與應用[J].飼料與畜牧，2010（8）：54-56.

[7]汪彬彬，車振明.Plackett-Burman和Box-Benhnken Design實驗設計法優化根霉產糖化酶發酵培養基的研究[J].食品科技，2011（5）：41-45.◇

Optimization of Process for Productionβ-glucosidase from Rape Straw

WANG Zhou1，XIAO lingling2，FENG Yumei1，GUO Jinling1，TIAN Yihong1，LV Yucai1，*GONG Dachun1
（1.Key Lab of Biocatalysis，China Three Gorges University，Yichang，Hubei443002，China；2.Hubei Three Gorges Polytechnic，Yichang，Hubei443002，China）

The production ability ofβ-glucosidase by solid state fermentation from rape straw is improved by the optimization of process.The effect of the ratio between the rape straw and bran，the ratio between the solid component and water，the temperature，the contain amountof（NH4）2SO4，the inoculum concentration，the initial pH，the fermentation time on theβ-glucosidase production is studied.The optimum conditions are obtained by the orthogonal design experiment of three factors and three levels.The results showed that the optimum conditions are the ratio 6∶4 between bran and rape straw，and the ratio 1∶1.8 between the solid and the water，the temperature 25℃，（NH4）2SO43%，the inoculum concentration 5%，the initial pH 4.7 for 4 dayswith 127.4 U/gβ-glucosidase activity，increasing 50%than before.

solid-state fementation；β-glucosidase；rape straw

S816.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.037

1671-9646（2017）06b-0026-03

2017-05-20

宜昌市科技攻關項目“纖維素糖化制備微生物柴油的工藝研究”（A15-301-b04）。

汪洲（1989—），男，在讀碩士，研究方向為微生物發酵。

*通訊作者：龔大春（1967—），男，博士，教授，碩士生導師，研究方向為微生物育種、發酵及新型酶制劑。