替米沙坦對(duì)高濃度葡萄糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響

孫 蓉，尚粉青

替米沙坦對(duì)高濃度葡萄糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響

孫 蓉1，尚粉青2*

目的 探討替米沙坦對(duì)高濃度葡萄糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響。方法 采用體外分離培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作為細(xì)胞模型，通過(guò)高濃度葡萄糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化，TGF-β抑制劑SB-431542或替米沙坦預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞6 h，然后用高濃度葡萄糖(30 mmol/L)孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h。RT-PCR和Western blot觀察CD31、VE-cadherin、α-SMA和Vimentin表達(dá)變化。應(yīng)用糖尿病小鼠模型驗(yàn)證上述指標(biāo)的變化。結(jié)果 高濃度葡萄糖可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β的表達(dá),而替米沙坦可抑制高濃度葡萄糖引起的TGF-β表達(dá)增加；高濃度葡萄糖可以降低內(nèi)皮細(xì)胞CD31、VE-cadherin的表達(dá)，增加α-SMA及Vimentin的表達(dá)。TGF-β抑制劑SB-431542及替米沙坦可以顯著逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響。結(jié)論 替米沙坦可以降低TGF-β的表達(dá)，抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化。

替米沙坦；高濃度葡萄糖；TGF-β；內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化

0 引言

心肌細(xì)胞纖維化是糖尿病心肌病發(fā)病過(guò)程中的重要機(jī)制，成纖維細(xì)胞激活、增殖是心肌纖維化過(guò)程中重要的病理過(guò)程。既往研究認(rèn)為，成纖維細(xì)胞只由自身活化而來(lái)，近年來(lái)研究表明，成纖維細(xì)胞并非同質(zhì)性細(xì)胞，而是一組高度異源的細(xì)胞群體，除由局部靜止的成纖維細(xì)胞活化而來(lái)外，內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激后向間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化(Endothelial-mesenchymal transition，EndMT)也是成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源之一，在心肌纖維化過(guò)程中起重要作用。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(Vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)作為內(nèi)皮細(xì)胞的特異分子，在EndMT過(guò)程中表達(dá)減少，而肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)作為間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，在EndMT過(guò)程中表達(dá)明顯增加。本文主要研究高濃度葡萄糖對(duì)EndMT的影響，并進(jìn)一步明確其機(jī)制及替米沙坦的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、試劑及儀器 替米沙坦購(gòu)自勃林格殷格翰制藥有限公司。葡萄糖、SB-431542購(gòu)自Sigma公司。主要試劑：PCR引物，生工(上海)有限公司合成。β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；CD31抗體、VE-cadherin抗體、α-SMA抗體及Vimentin抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(德國(guó)Roche公司)，ECL發(fā)光液(Vazyme公司，Millipore公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCRSuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器：實(shí)時(shí)定量PCR儀及梯度PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，WB電泳儀和電泳槽、WB半干轉(zhuǎn)膜槽(BIO-RAD公司)，自動(dòng)洗片機(jī)(柯達(dá)公司)。

1.1.2 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)本取自西安高新醫(yī)院婦產(chǎn)科孕婦足月正常娩出的臍帶組織。于無(wú)菌條件下獲得新生兒臍帶(長(zhǎng)約15～20 cm，無(wú)破損，無(wú)鉗夾痕跡)，置于冰的臍帶保鮮液(M199培養(yǎng)基40%，100×AB/M溶液0.8%，1 mol/L HEPES溶液0.4%，肝素鈉注射液0.144%)中，6 h內(nèi)進(jìn)行HUVECs分離。0.1%膠原酶灌注消化法分離HUVECs細(xì)胞。0.125%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 選用8～10周的SPF級(jí)雄性db/db和db/m小鼠(體重20 g左右,購(gòu)于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院)作為研究對(duì)象。20只8～10周的db/db小鼠(db/m小鼠8只作為對(duì)照組)，適應(yīng)環(huán)境1周后測(cè)定空腹血糖。隨機(jī)分為高糖組及替米沙坦組；替米沙坦組給予替米沙坦10 mg/(kg·d)每天灌胃治療，db/db組和db/m組給予生理鹽水。療程8周，其中4周末、8周末測(cè)定空腹血糖。8周末血糖測(cè)定完畢后，CO2麻醉方法處死小鼠，取主動(dòng)脈(升主動(dòng)脈-主動(dòng)脈弓-腹主動(dòng)脈)，PBS沖洗，液氮快速冰凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ性囼?yàn)操作已得到西安市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot分析 內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)PBS洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上裂解20 min；液氮凍融3次，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，ABC法測(cè)定蛋白濃度。加入loading buffer，95 ℃,8 min蛋白變性。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(上層膠30 mA，30 min；下層膠50 mA，90 min)，轉(zhuǎn)膜(230 mA，2 h)，5%脫脂牛奶(TTBS配制)封閉1 h，孵一抗4 ℃過(guò)夜，TTBS洗3遍，每遍5 min；孵二抗，室溫1 h；ECL發(fā)光，自動(dòng)洗片機(jī)洗片。標(biāo)定Marker，進(jìn)行掃描和分析。

1.2.2 Real time-PCR 六孔板每孔內(nèi)皮細(xì)胞加入Trizol 1 mL，提取RNA。小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RNA提取采用Trizol 1 mL沿主動(dòng)脈灌注，收集灌注液，提取RNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(參照HiScriptTMqPCR SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū))。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參照TaqMan universal PCR Master Mix說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖對(duì)EndMT的影響 不同濃度葡萄糖(5、10、30 mmol/L)孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h，RT-PCR結(jié)果提示，高濃度葡萄糖可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β的表達(dá)，同時(shí)降低內(nèi)皮細(xì)胞CD31、VE-cadherin的表達(dá)，增加α-SMA和Vimentin的表達(dá)。TGF-β抑制劑SB-431542(5 μmol/L)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞6 h，然后以甘露醇(25 mmol/L)作為對(duì)照組，用高濃度葡萄糖(30 mmol/L)孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h。RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果均提示,高濃度葡萄糖可以降低內(nèi)皮細(xì)胞CD31、VE-cadherin的表達(dá)，同時(shí)升高α-SMA及Vimentin表達(dá)，而SB-431542預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞可以顯著逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞CD31、VE-cadherin、α-SMA及Vimentin表達(dá)的影響。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 高濃度葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β表達(dá)的影響注：*與5 mmol/L組比較，P<0.05

圖2 高濃度葡萄糖對(duì)EndMT的影響注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與高糖組比較，P<0.05

2.2 替米沙坦對(duì)高濃度葡萄糖引起的EndMT的影響 替米沙坦(5 mmol/L)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞6 h，然后用高濃度葡萄糖(30 mmol/L)孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h，RT-PCR結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β的表達(dá)，而替米沙坦可顯著降低高濃度葡萄糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β表達(dá)的增加；RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果均提示，替米沙坦可以顯著逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞CD31、VE-cadherin、α-SMA及vimentin表達(dá)的影響。見(jiàn)圖3。

2.3 db/db糖尿病模型小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞各因子表達(dá)結(jié)果 與db/m小鼠相比，db/db小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β表達(dá)增加，CD31、VE-cadherin表達(dá)明顯減少，而α-SMA及Vimentin表達(dá)明顯增加。替米沙坦組TGF-β的表達(dá)較db/db小鼠降低，CD31、VE-cadherin表達(dá)明顯增加，而α-SMA及Vimentin表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖4。

圖3 替米沙坦對(duì)高濃度葡萄糖引起的EndMT的影響注：*與對(duì)照組比較P<0.05；#與高糖組比較，P<0.05

圖4 糖尿病模型小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞各因子表達(dá)結(jié)果注：與db/m組比較，*P<0.05,**P<0.01；與db/db組比較，#P<0.05

3 討論

多因素誘導(dǎo)的EndMT是心肌細(xì)胞纖維化發(fā)展的重要機(jī)制之一[1-3]。高濃度葡萄糖能夠促進(jìn)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞EndMT，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能和動(dòng)脈粥樣硬化[4]。研究表明，血管緊張素Ⅱ可介導(dǎo)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的EndMT[5]。內(nèi)皮素1和TGF-β可以誘導(dǎo)EndMT，而內(nèi)皮素-1受體拮抗劑Macitentan可有效抑制EndMT[6]。有報(bào)道，內(nèi)皮素1誘導(dǎo)的EndMT能夠促進(jìn)糖尿病小鼠心臟纖維化，基因敲除內(nèi)皮素1能夠減輕糖尿病小鼠心臟EndMT、纖維化及微血管減少。本研究表明，替米沙坦可以顯著抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的EndMT。Tang等[7-8]研究結(jié)果表明，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑厄貝沙坦亦有此作用。

TGF-β在內(nèi)皮細(xì)胞的EndMT中起重要作用。TGF-β可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)EndMT[9]。TGF-β通過(guò)上調(diào)Snail、β聯(lián)蛋白、纖溶酶原激活劑抑制因子1和ATp300，下調(diào)p53，以及引起包含mir-125b和mir-21在內(nèi)的多種miRNA表達(dá)失調(diào)促進(jìn)EndMT。TGF-β也可通過(guò)Smad和非Smad路徑促進(jìn)Snail的表達(dá)[10]。研究表明，在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，IL-1β和TGF-β2以NF-κB依賴的方式協(xié)同促進(jìn)EndMT[11]。由此可見(jiàn)，TGF-β在EndMT過(guò)程中是多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，有效抑制其表達(dá)有利于控制EndMT的發(fā)生和進(jìn)展。松弛素可減輕TGF-β所誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞EndMT，從而減輕心肌組織纖維化進(jìn)程[12]。人組織激肽釋放酶抑制蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)mir-21和內(nèi)皮一氧化氮合酶的表達(dá)，抑制TGF-β所誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞EndMT[13]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高濃度葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的EndMT作用，并進(jìn)一步證實(shí)高濃度葡萄糖可以通過(guò)TGF-β來(lái)誘導(dǎo)EndMT。替米沙坦可以通過(guò)降低TGF-β的表達(dá)，來(lái)抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的EndMT。

綜上所述，對(duì)于糖尿病的治療，無(wú)論是否合并高血壓，應(yīng)使用替米沙坦等藥物治療，這對(duì)于預(yù)防和治療糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

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Effect of telmisartan on endothelial-mesenchymal transition induced by high-concentration glucose

SUN Rong1,SHANG Fen-qing2*

(1.Department of Emergency，Xi′an Gaoxin Hospital,Xi′an 710075,China;2.Cardiovascular Department,the First Hospital of Xi′an,Xi′an 710002,China)

Objective To investigate the effect of telmisartan on endothelial-mesenchymal transition induced by high-concentration glucose.Methods Endothelial cells were isolated from human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).High-concentration glucose (30 mmol/L) was used to induce the endothelial-mesenchymal transition.The endothelial cells were pretreated by TGF-β inhibitor SB-431542 (5 μmol/L) or telmisartan (5 mmol/L) for 6 h,and were co-cultured with high-concentration glucose (30 mmol/L) for 48 h.The changes of CD31,VE-cadherin,α-SMA and vimentin were determined by RT-PCR and Western blot.Diabetic mice model was used to verify the changes of the above indicators.Results High-concentration glucose could increase the expression of TGF-β,which could be reversed by telmisartan.High-concentration glucose could decrease the expression of CD31 and VE-cadherin,and increase the expression of α-SMA and vimentin.TGF-β inhibitor SB-431542 and telmisartan could significantly reverse the effects of high-concentration glucose on endothelial-mesenchymal transition.Conclusion Telmisartan can reduce the expression of TGF-β,and inhibit the endothelial-mesenchymal transition induced by high-concentration glucose.

Telmisartan；High-concentration glucose；TGF-β；Endothelial-mesenchymal transition

2016-10-20

1.西安高新醫(yī)院急診科,西安 710075；2.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科,西安 710002

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707014