微生物乳糖酶研究進(jìn)展

賀璐，龍承星，劉又嘉，惠華英，譚周進(jìn)

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙，410208) 2(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208)3(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208) 4(湖南人文科技學(xué)院 數(shù)學(xué)與金融學(xué)院，湖南 婁底，417000)

微生物乳糖酶研究進(jìn)展

賀璐1，龍承星2,4，劉又嘉2，惠華英1，譚周進(jìn)3*

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙，410208) 2(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208)3(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208) 4(湖南人文科技學(xué)院 數(shù)學(xué)與金融學(xué)院，湖南 婁底，417000)

乳糖酶是一種分解乳糖產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖的雙糖酶，在乳品生產(chǎn)、醫(yī)藥助消化、果菜成熟軟化、環(huán)境保護(hù)等方面具有重大應(yīng)用價(jià)值。微生物是產(chǎn)乳糖酶的主要來源，具有生長繁殖快、酶量豐富、生產(chǎn)成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，對微生物乳糖酶研究從微生物乳糖酶特點(diǎn)、產(chǎn)乳糖酶主要微生物、基因工程技術(shù)在乳糖酶生產(chǎn)上的應(yīng)用及微生物乳糖酶的應(yīng)用等領(lǐng)域進(jìn)行了綜述，為產(chǎn)乳糖酶微生物的開發(fā)、乳糖酶基因工程技術(shù)的應(yīng)用等提供參考。

微生物；乳糖酶；特點(diǎn)；基因工程

乳糖酶能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，還可以通過半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用生成功能性低聚半乳糖，又稱β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactoside-galactohydrolase E.C.3.2.1.23)。乳糖酶在乳制品加工、醫(yī)藥、環(huán)境、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在醫(yī)藥上主要用來治療乳糖不耐受癥[1]。荷蘭生物學(xué)家1889年首次報(bào)道乳糖酶能水解乳糖以來[2]，乳糖酶的研究日漸完善。20世紀(jì)60年代，國外學(xué)者成功研制出一系列微生物乳糖酶商品并投放市場，國內(nèi)在20世紀(jì)80年代以后開始微生物乳糖酶的研究，但主要集中在產(chǎn)酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、乳糖酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)等的研究，取得了一些進(jìn)展。

乳糖酶的來源非常豐富，包括植物來源、動物來源和微生物來源。植物來源如杏、李、桃、蘋果和咖啡豆等，動物來源主要有腸、腦、消化器官和皮膚組織，微生物來源有細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等，只有微生物乳糖酶具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[3]。本文主要?dú)w納總結(jié)了微生物乳糖酶的生化特性、主要產(chǎn)酶菌株及高產(chǎn)菌株的優(yōu)化方法和微生物乳糖酶的應(yīng)用。

1 微生物乳糖酶的特點(diǎn)

微生物具有代謝高效、生長繁殖快的優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用優(yōu)勢明顯。微生物乳糖酶性質(zhì)多樣、來源廣泛、酶活力高且容易制備。利用微生物發(fā)酵法制備乳糖酶具有周期短、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，且不受地理位置、季節(jié)等的影響，能滿足各種需求且便于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，是目前商用乳糖酶的主要生產(chǎn)方法[4]。乳糖酶分為胞外酶和胞內(nèi)酶，細(xì)菌和酵母菌產(chǎn)生的乳糖酶一般為胞內(nèi)酶，霉菌產(chǎn)生的乳糖酶為胞外酶。不同來源的微生物乳糖酶性質(zhì)差異巨大(表1)，細(xì)菌乳糖酶一般為常溫乳糖酶，最適作用溫度一般在40 ℃左右，如卷曲乳桿菌ATCC33820和大腸桿菌的乳糖酶的最適溫度分別為45 ℃和40 ℃。有些細(xì)菌乳糖酶的作用溫度可達(dá)90℃，也有些耐冷產(chǎn)乳糖酶菌株產(chǎn)生的乳糖酶在低溫下仍保持較高酶活性，如拉恩氏茵屬(Rahnellasp.)產(chǎn)生的乳糖酶在4 ℃仍保持最高酶活性的40%[5]。細(xì)菌乳糖酶的最適pH值近中性，一般為6.5～7.5，具有酶性質(zhì)穩(wěn)定、易于發(fā)酵等優(yōu)勢。酵母菌乳糖酶的最適作用溫度一般在37 ℃左右，最適作用pH近中性，與牛乳的天然pH值接近，被廣泛用于牛乳和乳清中乳糖的水解，但由于是胞內(nèi)酶，不易提取[6]。霉菌產(chǎn)生的乳糖酶是胞外酶，提取方便，一般作用溫度較高，在50 ℃以上，最適pH值偏酸性，分子量較小，主要用于酸性乳清和干酪的水解。微生物乳糖酶的用途廣泛，但游離的乳糖酶存在價(jià)格昂貴、添加量大且不利于產(chǎn)品分離純化等缺點(diǎn)，研究者們在固定化酶方面進(jìn)行了研究與探索。研究表明，利用殼聚糖微球載體、苯乙烯馬來酸酐共聚物納米纖維載體和氨基化細(xì)菌纖維素載體固定β-半乳糖苷酶，能使乳糖酶具較好的儲存和操作穩(wěn)定性，并能提高酶的活性和回收利用率[7]。

表1 一些微生物乳糖酶的性質(zhì)

2 產(chǎn)乳糖酶的主要微生物

微生物種類多，特性不一。產(chǎn)乳糖酶的微生物有細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌，其中細(xì)菌占絕大多數(shù)，其次是霉菌，酵母菌和放線菌較少。大量細(xì)菌能產(chǎn)生乳糖酶，但僅有極少數(shù)的細(xì)菌可作為乳糖酶的安全來源，Streptococcusthermophilus是其中的一種，可用作酸奶酪和一些乳酪的發(fā)酵劑[16]。酵母菌可產(chǎn)生大量的乳糖酶，適用于牛奶和乳清的水解，主要包括Klugeveromycesmarxianus、Klugeveromyceslactis、Guchomycespullulans和Candidakefr[20]。目前常用的乳糖酶制劑來源菌中，乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、米曲霉和黑曲霉等在食品工業(yè)中被認(rèn)為是安全的[21]，符合美國FDA(Food and Drug Administration)的GRAS (generally regarded as safe) 的要求。表2列舉了一些主要的產(chǎn)乳糖酶微生物及商品化乳糖酶，例如荷蘭帝斯曼公司的來源于乳酸克魯維酵母的Maxilact系列、美國紐約酶發(fā)展公司生產(chǎn)的來源于黑曲霉的Fungal lactase，我國的哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的中性乳糖酶來源于脆壁克魯維酵母，但乳糖酶產(chǎn)量依然偏低，在乳品工業(yè)中的應(yīng)用仍受到限制。以后的研究中，應(yīng)著力于研究如何提高微生物商品化乳糖酶的產(chǎn)量，使其能更好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

表2 產(chǎn)乳糖酶的微生物及其商品化乳糖酶

3 乳糖酶高產(chǎn)菌株的選育

乳糖酶在醫(yī)藥、乳品、環(huán)境保護(hù)、分析等方面應(yīng)用廣泛，然而產(chǎn)量低下限制了乳糖酶的應(yīng)用及規(guī)模化生產(chǎn)。研究者們在乳糖酶高產(chǎn)菌株選育方面開展了大量的工作，主要技術(shù)集中在誘變育種和基因工程。乳糖酶高產(chǎn)菌株的誘變選育主要是通過60Co-γ射線照射、紫外線照射和亞硝基胍處理等進(jìn)行誘變后，然后進(jìn)行篩選。采用紫外線和60Co-γ射線協(xié)同誘變對出發(fā)菌株Uco-3的原生質(zhì)體進(jìn)行處理后，篩選突變株產(chǎn)生的乳糖酶活性由原來的16.27 u/mL可以提高到44.37 u/mL[44]。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，乳糖酶高產(chǎn)菌株的選育取得了很好的成效。基因工程技術(shù)將性狀優(yōu)良的乳糖酶基因?qū)胍子谂囵B(yǎng)且生長迅速的微生物，獲得重組乳糖酶基因工程菌，再進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，提高乳糖酶生產(chǎn)含量，降低生產(chǎn)成本。乳糖酶基因的表達(dá)系統(tǒng)有三大類，分別是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最成熟、最廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，具有產(chǎn)量高、成本低、生長快及遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，但真核基因在這種表達(dá)系統(tǒng)中沒有翻譯和修飾功能，所表達(dá)的目的蛋白常以不溶性包涵體形式存在，必須通過變性復(fù)性得到天然活性蛋白，表達(dá)的產(chǎn)物往往沒有生物活性或生物活性很低。將嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳糖酶基因?qū)氪竽c桿菌后進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白的催化活性高出原來菌株約50倍，這是因?yàn)槭葻嶂狙挎邨U菌的乳糖酶基因是原核基因，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中能直接表達(dá)[45]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前發(fā)展最迅速、應(yīng)用最廣泛的外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中具有無比廣闊的前景，主要特點(diǎn)是能利用甲醇作為能量來源和唯一碳源。這種表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白修飾和翻譯功能，穩(wěn)定性高、表達(dá)能力強(qiáng)、遺傳背景清楚、生長迅速，易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，適合高密度的發(fā)酵培養(yǎng)和商業(yè)化生產(chǎn)。把環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的乳糖酶基因?qū)氘叧嘟湍钢羞M(jìn)行表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量提高了2倍[46]。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)操作安全、簡單、可誘導(dǎo)表達(dá)，也被廣泛用于外源基因的表達(dá)。除此之外，還可以通過基因敲除的方法獲得乳糖酶高產(chǎn)菌株。基因敲除技術(shù)是上世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的，是指通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)，主要包括同源重組技術(shù)、基因隨機(jī)插入突變和RNAi基因敲除技術(shù)。將K.Marxianukm菌株的MIG1基因敲除后，乳糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平提高了2倍，酶生物合成量也明顯提高[47]。隨著新技術(shù)的發(fā)展，乳糖酶高產(chǎn)菌株的選育將有更大的進(jìn)步。

利用基因工程技術(shù)得到的高產(chǎn)菌株固然能增大乳糖酶的產(chǎn)量，然而將其廣泛應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)還存在諸多問題。比如技術(shù)要求高導(dǎo)致生產(chǎn)成本升高；乳糖酶主要應(yīng)用于食品醫(yī)藥方面，轉(zhuǎn)基因菌株生產(chǎn)的酶可能存在潛在的危害。

4 微生物乳糖酶的應(yīng)用

4.1 食品方面的應(yīng)用

微生物來源的乳糖酶在食品工業(yè)中的一個(gè)重要應(yīng)用是合成低聚半乳糖。低聚半乳糖是一種益生元，能夠改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)。低聚半乳糖難以被小腸吸收，還具有糖類的共有屬性和較好的口感，被廣泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的無熱量食品。工業(yè)上低聚半乳糖主要采用酶法合成，尤其以微生物來源的β-半乳糖苷酶為主。β-半乳糖苷酶既能催化β-D-半乳糖苷鍵的水解，也可催化半乳糖基轉(zhuǎn)移生成低聚半乳糖的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，因此能催化乳糖生成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶制作的酸乳風(fēng)味和口感較好，保質(zhì)期較一般乳制品長。

4.2 醫(yī)藥方面的應(yīng)用

乳糖不耐受癥是目前在全世界人群中較常出現(xiàn)的一種癥狀，醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)ⅵ?半乳糖苷酶做成酶制劑，以治療乳糖不耐受癥疾病以及多種兒童消化不良癥[5]。

4.3 作為報(bào)告基因的應(yīng)用

β-半乳糖苷酶可作為某些檢測載體的報(bào)告基因或用于腸桿菌的鑒定。如利用β-半乳糖苷酶水解對硝基酚-β-D-半乳糖苷，生成對硝基酚(pNP)游離而呈現(xiàn)黃色的性質(zhì)，采用酶標(biāo)儀在405 nm波長下比色，依據(jù)光密度值確定腸桿菌中具有β-半乳糖苷酶的菌屬的菌量[48]。李杰[49]等研究發(fā)現(xiàn)，利用β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)告基因構(gòu)建耐輻射異常球菌啟動子的檢測載體，能深入了解耐輻射異常球菌的抗逆基因在不同脅迫下的功能。

4.4 免疫和檢測的應(yīng)用

金國祥建立了以β-半乳糖苷酶為標(biāo)志性抗原的小鼠黑色素瘤模型——galBl6腫瘤模型，以β-半乳糖苷酶表達(dá)載體作為DNA疫苗，在galBl6腫瘤模型上做了抗腫瘤免疫的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明β-半乳糖苷酶基因疫苗具有抑制galBl6腫瘤生長的作用[50]。

4.5 環(huán)保方面的應(yīng)用

乳清中含有乳糖、維生素、乳清蛋白和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，每年世界上約產(chǎn)乳清9×107T，其中50%當(dāng)廢水排放，不僅造成浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。用β-半乳糖苷酶水解乳清中的乳糖，可以提高含乳清飼料的營養(yǎng)價(jià)值，減少環(huán)境污染。

4.6 果蔬軟化方面的應(yīng)用

果蔬軟化是在細(xì)胞壁多糖降解酶的作用下，細(xì)胞壁多糖發(fā)生降解，高聚物解離，細(xì)胞壁組織變軟導(dǎo)致肉質(zhì)軟化。β-半乳糖苷酶可以讓細(xì)胞壁的組分不穩(wěn)定，并通過具支鏈的多聚醛酸的降解來溶解果膠，使果蔬軟化。

5 結(jié)束語

乳糖酶缺乏或乳糖不耐受是全球面臨的問題，影響了全世界近2/3的人群，對人類的健康造成了很大的威脅。微生物乳糖酶因微生物繁殖快、低生產(chǎn)成本、高酶活力等備受研究者的青睞。目前對微生物乳糖酶的研究主要在于篩選乳糖酶高產(chǎn)菌株，降低乳糖酶生產(chǎn)成本。常溫乳糖酶水解速率慢、酶需要量大，且容易造成牛奶體系的雜菌污染等問題，并且我國乳品生產(chǎn)大多在低溫環(huán)境下進(jìn)行，因而也促使高產(chǎn)耐熱和耐低溫的乳糖酶生產(chǎn)菌株的開發(fā)，有望解決這些問題。

利用微生物育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展乳糖酶基因工程確實(shí)可以大大提高乳糖酶產(chǎn)量，但其安全性也有待于進(jìn)一步提高。為了促進(jìn)我國乳品工業(yè)的迅速發(fā)展，全面解決乳糖不耐受，開發(fā)高質(zhì)量且安全的乳糖酶及對乳糖酶生物學(xué)特性的研究、探索其規(guī)律性、實(shí)現(xiàn)乳糖酶工業(yè)化低成本生產(chǎn)仍是巨大的挑戰(zhàn)。此外，乳糖酶在食品行業(yè)之外的應(yīng)用也有待進(jìn)一步發(fā)掘。

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Research progress on microorganism lactase

HE Lu1, LONG Cheng-xing2,4, LIU You-jia2, HUI Hua-ying1, TAN Zhou-jin3*

1(College of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)2(College of Chinese Traditional Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)3(Medical College, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)4(College of Mathematics and Finance, Hunan University of Humanities Science and Technology, Loudi 417000, China)

As a kind of disaccharidase, lactase could decompose lactose into galactose and glucose, and thus applied into dairy production, medical aid digestion, fruit mature softening and environmental protection and so on. As the main source of lactase, microorganism had many characteristics such as fast growing speed, rich enzyme amount, low production cost, and thus was suitable for industrial production. The study of microorganism lactase was mainly focused on the development of lactase-producing microorganisms and application of lactase gene engineering. Herein the research on the characteristics of microorganism lactase, main lactase-producing microorganism, application of engineering to lactase production and the application of microorganism lactase were reviewed.

microorganism; lactase; characteristic; gene engineering

碩士研究生(譚周進(jìn)教授為通訊作者，E-mail：tanzhjin@sohu.com)。

國家自然科學(xué)基金(81573951); 長沙市科技局項(xiàng)目(k1508025-21); 湖南省教育廳項(xiàng)目(16C1202)

2016-12-31，改回日期：2017-02-21

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706046