外翻腸囊法研究肝豆湯醇提物主要成分的腸吸收特征

劉藝+程梅梅+董健健+周安

[摘要] 為了探究復方肝豆湯醇提物中主要化學成分的腸吸收特性，該文采用大鼠外翻腸囊模型，選擇肝豆湯醇提物中鹽酸小檗堿、槲皮素、山柰素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素6種主要成分作為考察對象，評價各成分在不同腸段的吸收特征。結(jié)果表明，肝豆湯醇提物中6種成分均可進入腸囊，在高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的肝豆湯醇提物中，鹽酸小檗堿、槲皮素、山柰素3種成分在不同腸段的吸收均為線性吸收，符合零級吸收速率，且在空腸與回腸中吸收速率常數(shù)Ka隨著劑量增加均增加（P<0.05），符合被動吸收；而大黃酸在空腸和回腸中的Ka隨著劑量增加并無顯著性差異，符合主動轉(zhuǎn)運。大黃酚和蘆薈大黃素2種成分在腸段中吸收均較差。提示腸囊對肝豆湯醇提物中藥物成分吸收具有選擇性，各成分在腸囊中的吸收特征并不完全相同。

[關(guān)鍵詞] 肝豆湯醇提物；多組分；外翻腸囊法；吸收速率常數(shù)

[Abstract] To study the intestinal absorptive characteristics of the ethanol extracts from Gandou decoction（GDD）， everted intestinal sac models were used. The six representative ingredients （berberine hydrochloride， quercetin， kaempferide， rhein， chrysophanol， and aloe emodin） of GDD， were selected as the experimental targets to investigate the absorptive characteristics of various ingredients in different intestinal sections. The results showed that all six ingredients from GDD were detected in the intestinal sac， three active ingredients （berberine hydrochloride， quercetin， kaempferide） in high， medium and low doses had linear absorption properties in the small intestine segment， consistent with zero-order absorption rate；in addition， the absorption rate constant （Ka） of three components in jejunum and ileum were increased with the increase of the concentration of GDD （P<0.05）， consistent with passive absorption. However， the Ka of rhein in jejunum and ileum showed little difference with the increase of dosage， suggesting a possibility of active transport mechanism. Chrysophanol and aloe-emodin were poorly absorbed in the two segments， which had not been detected in the previous time. The results suggested that the components of GDD were selectively absorbed in the intestinal sac， and the absorption characteristic of the ingredients were not exactly similar.

[Key words] ethanol extracts of Gandou decoction；multi-component；everted intestinal sac； Ka

肝豆湯用于治療肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration， HLD）已有40年歷史，具有清熱解毒，利尿通淋，活血化瘀的功效，臨床療效確切[1-2]，2008年被《肝豆狀核變性診斷與治療指南》推薦為常規(guī)治療HLD基本方[3-4]。前期研究表明，肝豆湯含藥血清具有顯著的細胞內(nèi)排銅作用，能夠通過多靶點、多途徑調(diào)控銅代謝通路達到細胞內(nèi)排銅效果[5]。

肝豆湯由大黃、黃連、姜黃、金錢草、澤瀉、三七6味藥組方而成，成分復雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，限制了其質(zhì)量控制及開發(fā)應用。通常認為中藥及其復方口服給藥后只有經(jīng)胃腸吸收入血，通過血液循環(huán)才能夠發(fā)揮藥效作用。為了明確肝豆方中主要成分的腸吸收特性，本研究選取肝豆湯中具有代表性的蒽醌、黃酮和生物堿3類成分為考察對象，建立方中鹽酸小檗堿、槲皮素、山柰素、大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素6種成分的超高效液相色譜（UPLC）檢測方法，通過外翻腸囊模型研究肝豆湯醇提物中6種化學成分的腸吸收特征，為肝豆湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agelent 1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；混合氣瓶：95% O₂，5% CO₂（合肥公益化工產(chǎn)品有限責任公司）；麥氏浴槽；CP225D型1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；Eppendorf AG 5401高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 動物

健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，SPF級，體重（230±20）g，由安徽省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號2011（皖）-002。

1.3 藥物與試劑

大黃、黃連、姜黃、澤瀉、金錢草、三七等6味藥材購于安徽合肥市同仁堂大藥房，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心劉先華老師鑒定；氯化鈉（NaCl，批號20140806）、氯化鉀（KCl，批號20150111）、碳酸氫鈉（NaHCO₃，批號20140901）、磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄，批號20140406）、氯化鎂（MgCl₂，批號20140222）、氯化鈣（CaCl₂，批號20140301）、無水葡萄糖（批號20140504）均購自國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸小檗堿（批號110713-201212）、槲皮素（批號100081-200406）購于中國食品藥品檢定研究院；山柰素（批號150122）、大黃酸（批號150904）、大黃酚（批號151028）、蘆薈大黃素（批號150730）購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所。

乙腈（色譜純，TIEDA公司），甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），蒸餾水（本中心自制），甲酸（天津市光復精細化工研究所，批號20130625）。

2 方法與結(jié)果

2.1 Tyrode緩沖液的配制的配制

按文獻[6]方法，精密稱取NaCl 8.0 g，KCl 0.28 g，MgCl₂ 0.1 g，NaHCO₃ 1.0 g，NaH₂PO₄ 0.05 g溶于500 mL蒸餾水中，密閉冷藏；另稱取0.2 g CaCl₂溶于500 mL蒸餾水中密閉冷藏；使用前將2種溶液混合后加入無水葡萄糖1.0 g，并用玻璃棒攪拌均勻，即得 Tyrode 緩沖液。

2.2 肝豆湯醇提物的制備

按處方比例取6味藥適量，加入8倍量50%乙醇回流提取3次，每次1 h，濾過合并濾液，濃縮，即得肝豆湯醇提物樣品。臨用前用 Tyrode 緩沖液稀釋成相當于生藥材質(zhì)量濃度分別為116，58，29 g·L^-1的肝豆湯醇提物溶液。

2.3 混合對照品儲備液的配制

精密稱取適量鹽酸小檗堿、槲皮素、山柰素、大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素對照品于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。精密移取各對照品溶液適量，用甲醇配制成混合對照品儲備液（含鹽酸小檗堿91.0 mg·L^-1，槲皮素75.1 mg·L^-1，山柰素34.7 mg·L^-1，大黃酸18.5 mg·L^-1，蘆薈大黃素12.5 mg·L^-1，大黃酚6.56 mg·L^-1），備用。

2.4 色譜方法

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；以水（含0.05%甲酸）為流動相A，乙腈（含0.05%甲酸）為流動相B，梯度洗脫0～4 min，10%～20%B；4～10 min，20%～30%B；10～15 min，30%～40%B；15～18 min，40%～50%B；18～23 min，50%～75%B；23～25 min，75%～85%B；25～27 min，85%～100%B。流速0.4 mL·min^-1；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣體積5 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 比較空白腸液、混合對照品溶液加空白腸液、肝豆湯醇提物及肝豆方腸外翻樣品（質(zhì)量濃度為58 g·L^-1，給藥120 min）色譜圖，在2.4項色譜條件下檢測，6種成分完全分離且各峰峰形良好，空白腸液及供試品溶液中其他成分對分析檢測并無干擾，說明該方法專屬性較好，見圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察 取已配制的混合對照品儲備液適量，加甲醇稀釋2，5，10，20，40，80倍，得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。分別取200 μL，加入空白腸液200 μL，甲醇200 μL，渦旋混勻，以12 000 r·min^-1離心15 min，取上清液5 μL進樣分析。以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，mg·L^-1）進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，見表1。

2.5.3 精密度試驗 按照2.4項色譜條件，取同1個混合對照品溶液，在同1 d內(nèi)連續(xù)測定6次，考察日內(nèi)精密度、鹽酸小檗堿、槲皮素、山柰素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素峰面積RSD分別為0.025%，0.090%，0.29%，0.29%，0.074%，0.24%；每天測定1次，連續(xù)測定6 d，考察日間精密度，得到各成分峰面積的RSD分別為0.047%，0.071%，0.25%，0.27%，0.11%，1.1%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一個肝豆湯腸外翻供試品溶液，在0，2，4，6，8，12，24 h進樣分析，測定其峰面積。計算各成分峰面積RSD均小于2.5%，表明肝豆湯腸外翻供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 回收率試驗 分別取200 μL高、中、低不同濃度混合對照品各3份，再加入空白腸液200 μL，甲醇200 μL，渦旋混勻離心取上清液進行測定，得到峰面積AT；另取3個濃度對照品200 μL各3份，加入400 μL甲醇溶液，直接測定，得到峰面積AS，計算提取回收率r=AT/AS×100%，提取回收率在90.3%～95.6%，RSD在1.9%～3.0%，符合生物樣品分析要求。

2.6 大鼠腸外翻吸收實驗

2.6.1 大鼠外翻腸囊模型實驗 SD大鼠，在實驗前12 h禁食，自由飲水。脫頸處死大鼠后，沿腹中線剪開，小心將大鼠腸管與腸系膜剝離，快速取空腸、回腸各10 cm，放入0 ℃ Tyrode緩沖液中沖洗，將腸內(nèi)容物沖凈為止。將腸管一端結(jié)扎于自制圓管，小心翻轉(zhuǎn)并將腸末端結(jié)扎成囊狀，向腸管中注射2 mL Tyrode緩沖液，作為受藥體系，將其置于已有緩沖液的麥氏浴槽中，實驗過程中保持37 ℃恒溫，并向浴槽中通入95%氧氣和5%二氧化碳。平衡5 min后將體系放入裝有20 mL肝豆湯醇提物溶液的麥氏浴槽中，分別在15，30，45，60，90，120 min時從腸囊內(nèi)取樣200 μL，同時補足200 μL的空白Tyrode 緩沖液。實驗結(jié)束后，剪開腸管，自然平攤于濾紙上測量長度和寬度，記錄吸收表面積A[7]。

2.6.2 腸外翻供試品溶液制備 按2.6.1項方法進行實驗，制備各時間點不同腸段的樣品。取200 μL腸外翻樣品，定量加入甲醇400 μL，渦旋混勻，離心取上清液，即得肝豆湯腸外翻供試品溶液。按2.4項色譜條件進行分析，計算各腸段中各成分的累積吸收量（μg），繪制Q累積吸收量-t曲線，計算吸收速率常數(shù)（Ka）[8-9]。

2.6.3 計算方法 根據(jù)以下公式計算藥物累積吸收量Q[10]。

Q累積吸收量= 0.2Cn×V平衡V取樣+ 0.2∑n-1i=1Ci

Q為藥物各時間點的累積吸收量（μg），Cn為各時間點檢測到的質(zhì)量濃度（mg·L^-1）。以藥物的累積吸收量對時間作相關(guān)回歸分析，斜率（K）除以吸收表面積（A），即為吸收速率常數(shù)（Ka，μg·min^-1·cm-2），公式為Ka=K/A。

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，各組間數(shù)據(jù)通過單因素方差分析（One-Way analysis of variance，ANOVA）進行比較，P<0.05則具有統(tǒng)計學意義。

2.7 腸外翻樣品測定及結(jié)果

2.7.1 不同濃度肝豆湯醇提物中各成分在空腸和回腸中累積吸收量的比較 在不同濃度的肝豆湯醇提物中6種成分均可吸收進入腸囊，大黃酚和蘆薈大黃素含量較低，90 min后才被檢測到；大黃酸最早在空腸45 min時檢測到；山柰素除在低濃度中15 min時回腸段未檢測到，其他時間點均可檢測到；鹽酸小檗堿和槲皮素2種成分在2個腸段各個時間點均可檢測到。將累積吸收量（Q）-時間（t）作圖，做線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)r均達到0.99以上，說明各成分在不同濃度不同腸段中符合零級吸收速率，見圖2。在3個濃度下，鹽酸小檗堿在回腸中吸收量均大于空腸，大黃酸空腸吸收量大于回腸，且差異顯著。槲皮素與山柰素在高、中濃度下，回腸與空腸累積吸收量并無顯著性差異；但在低濃度中，空腸累積吸收量卻高于回腸，并具有顯著性差異，見表2。

2.7.2 不同濃度肝豆湯醇提物中各成分在空腸和回腸中Ka的比較 按2.6.3項計算低、中、高3個濃度中肝豆方各成分的吸收速率常數(shù)（Ka），見表3。結(jié)果表明鹽酸小檗堿，槲皮素，山柰素這3個成分均具有濃度依賴性，即Ka均隨著濃度的增大而增大，說明這3個成分的吸收方式為被動擴散。而大黃酸最早在回腸45 min時檢測到，且Ka隨濃度的變化無明顯變化，說明大黃酸可能是主動吸收。其中大黃酚及蘆薈大黃素在90 min后才被檢測到，無法計算其Ka。

3 討論

3.1 肝豆湯醇提物中指標成分的選取及吸收情況

復方肝豆湯中君藥為大黃，其主要活性成分為游離蒽醌類成分，臣藥黃連和金錢草中主要活性成分別為生物堿類和黃酮類成分，因此在考察腸吸收特征時選取鹽酸小檗堿、槲皮素、山柰素、大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素6種具有代表性成分?？赡苡捎诟味箿继嵛镏写簏S蒽醌類成分含量相對較少，吸收能力較差，腸吸收液中蒽醌類成分含量較低[11]，在前幾個時間點采用UPLC未能檢測到，這為后期體內(nèi)探究入血成分做出提示，90 min后做為取血點可能較為合適。通過體外的吸收的實驗結(jié)果可推測入血成分，為進一步闡明肝豆湯可被吸收入血的主要活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

3.2 肝豆湯醇提物中各成分的腸吸收特征

實驗結(jié)果表明，槲皮素、山柰素2種黃酮類化合物在空腸和回腸段的Ka隨著肝豆湯劑量增大而增大且具有顯著性差異，符合被動吸收，但在2個腸段吸收量并沒有顯著性差異。大黃酸在空腸和回腸中隨著濃度的增大Ka并無明顯差異，可能符合主動轉(zhuǎn)運，但在中濃度空腸吸收早于回腸，且吸收量比回腸大，具有顯著性差異，提示空腸可能是大黃酸主要的吸收腸段。鹽酸小檗堿在空腸與回腸中Ka隨著劑量增大而增大，差異顯著，符合被動吸收，在回腸中的吸收量高于空腸具有顯著性差異。但是有文獻[12]報道在扶正消癥方中的小檗堿在小腸的吸收方式不僅有被動擴散還有主動轉(zhuǎn)運，在回腸中的吸收量雖然略高于空腸，但并沒有顯著性差異，且在黃連-大黃藥對中小檗堿腸吸收特征報道[11]為被動擴散，空腸的吸收明顯優(yōu)于其他腸段，與本研究結(jié)論均存在著一定差異。肝豆湯中鹽酸小檗堿的吸收規(guī)律與其他復方和黃連提取物中小檗堿的吸收規(guī)律不一致，提示著復方中的其他藥味對于鹽酸小檗堿的吸收影響顯著。中藥復方并不僅僅是各單味藥的簡單組合，藥物之間的相互作用、轉(zhuǎn)化，對藥效的變化產(chǎn)生重要的影響，不同復方中所含相同化合物的腸吸收特征并不一定完全相同。

[參考文獻]

[1] 薛本春，楊任民，胡紀源，等. 肝豆湯Ⅳ號聯(lián)合短期驅(qū)銅治療對肝豆狀核變性患者肝纖維化血清學指標的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（9）：785.

[2] 張杰，胡紀源，馬心鋒，等. 肝豆湯合驅(qū)銅療法對肝豆狀核變性患者生活質(zhì)量影響的前瞻性研究[J]. 安徽中醫(yī)藥大學學報，2015，34（1）：14.

[3] 梁秀齡，楊任民，吳志英，等. 肝豆狀核變性診斷與治療指南[C].長春： 第十一屆全國神經(jīng)病學學術(shù)會議， 2008.

[4] Roberts E A， Schilsky M L. Diagnosis and treatment of Wilson disease：an update[J]. Hepatology， 2008， 47（6）：2089.

[5] 董健健，韓詠竹，程楠. 肝豆湯對Wilson病模型TX小鼠肝細胞內(nèi)銅代謝通路的分子調(diào)控機制[J]. 中國實驗方劑學雜志，2016，22（24）：128.

[6] 朱晶晶，王智民，龔慕辛，等. 基于腸吸收的質(zhì)量評價指標選擇的方法和原則[J]. 中國中藥雜志，2011，35（6）：659.

[7] Rui H，Xu Y，Peng J， et al. The effects of 18β-glycyrrhetinic acid and glycyrrhizin on intestinal absorption of paeoniflorin using the everted rat gut sac model[J]. J Nat Med， 2017，71（1）：198.

[8] 時軍，翟李翔，許維桐. 白芷提取物對綠原酸腸吸收的影響[J]. 中成藥，2016，38（11）：2355.

[9] 劉躍，唐麗，曹旭，等. 葒草提取物的腸外翻吸收研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（11）：2121.

[10] 趙潔，徐雪林，易紅，等. 外翻腸囊法研究丹參水提物在大鼠腸內(nèi)的吸收[J]. 中國中藥雜志，2015，40（15）：3088.

[11] 陳凱，王月亮，陳彥，等. 外翻腸囊法評價黃連-大黃藥對不同提取工藝中生物堿的腸吸收特性[J]. 中國中藥雜志，2015，40（24）：4853.

[12] 謝小珂，閆利華，朱晶晶，等. 外翻腸囊法研究扶正消癥方中黃連堿類在大鼠腸內(nèi)的吸收[J]. 中國中藥雜志，2016，41（11）：2144.

[責任編輯 張燕]