七白散軟膏皮膚毒性的動物實驗研究

張 倩 熊亞敏 王榮帥 姜 波 張錦明

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院,哈爾濱,150001)

七白散軟膏皮膚毒性的動物實驗研究

張 倩 熊亞敏 王榮帥 姜 波 張錦明

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院,哈爾濱,150001)

目的:觀察七白散軟膏對動物皮膚的毒性作用。方法:通過七白散軟膏對SD大鼠的皮膚急性毒性實驗、單次、多次給藥刺激性實驗、眼部刺激性實驗及皮膚主動過敏實驗,以皮膚的刺激性評價分數為指標,對七白散軟膏的體外安全性進行評價。結果:單次和多次給予受試藥物,水腫和紅斑現象在SD大鼠完整皮膚組均未顯現;紅斑現象在SD大鼠破損皮膚組單次和多次給藥時均略有顯現,但停用藥物后可完全消退。基于皮膚的刺激強度評分標準,單次和多次給藥的刺激指數均小于0.5,所以七白散軟膏外用對皮膚無刺激性。皮膚主動過敏實驗表明,陽性致敏物的致敏率為100%,即稱之為極度致敏性;任何紅斑和水腫等過敏現象在七白散軟膏組和空白軟膏組對于致敏接觸中和激發接觸試驗中均未顯現,即致敏率為0。結論:通過體外安全性考察,七白散軟膏對皮膚無刺激性并不產生過敏現象,作為外用軟膏制劑,七白散軟膏安全可靠。

七白散;急性毒性;刺激性;致敏性

七白散作為一種上古名方,遠至宋朝古書就有所記載。其中七白被制作的劑型也多種多樣,有七白湯劑、七白微粉、七白膏劑等[1-3]。現代研究表明,七白散具有清除氧自由基[4],增強SOD活性和降低MDA含量并且抑制絡氨酸酶活性的作用,從而達到治療黃褐斑并具有美白功效[5-6]。軟膏劑作為一種經皮給藥的劑型,不僅能避免藥物對于胃腸道的破壞[7],而且通過皮膚對藥物的吸收起到治療作用。現已在醫院的皮膚科、外科得到廣泛應用,并占有一定的比重[8-9]。“內病外治”現如今已成為中藥軟膏劑的研究發展方向之一。本文為考察“七白散”軟膏劑的體外安全性,并為其開發和利用提供更多的實驗依據,參照新藥審批辦法[10]中的關于毒理學實驗技術要求及相關文獻[11-12],對自制的七白散軟膏進行皮膚急性毒性試驗、皮膚刺激性試驗、眼部刺激性試驗和皮膚主動過敏試驗的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠,體重250～300 g,雌雄各半(購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司,編號SCXK(吉)-2011-0004)。本研究實驗方案及實驗動物的飼養與使用處置,均通過哈爾濱醫科大學附屬第一醫學院實驗動物倫理委員會審批。

1.1.2 藥物 白術、白芷、白芨、白蒺藜、白僵蠶、白茯苓、浙貝母(七味中藥飲片均由哈爾濱藥材市場采購,由黑龍江中醫藥大學佳木斯學院陳效忠副教授鑒定)。取以上7種中藥飲片共32.5 g,于溫室下用70%的乙醇回流提取1 h后,再用旋轉蒸發儀抽濾,濾液于旋轉蒸發儀濃縮至5 mL左右,用真空干燥箱烘干,得到浸膏,將浸膏用研缽研磨制得浸膏粉。將16-18醇、白油、聚二甲基硅氧烷混合后在純化水中加熱至80 ℃,加入2,6-二叔丁基對甲酚進行溶解,待完全溶解后加入硬脂醇醚-2和硬脂醇醚-21,充分溶解混合后將此作為油相。待純化水加熱至80 ℃時,將溶解后的EDTA-2Na中加入甘油和丙二醇,最后加入七白散浸膏進行分散,將此作為水相。將水相加入到油相中,用勻質機進行勻質5 min,最后攪拌并降溫至40 ℃,加入LGP攪拌均勻,即得成膏。

1.1.3 試劑與儀器 納米速效脫毛膏(廣州喜化妝品有限公司);2,4-二硝基氯代苯(天津市光復精細化工研究所);電子天平(BP211D,德國sartorius公司)。

1.2 方法

1.2.1 皮膚急性毒性實驗 選取健康的SD大鼠30只,隨機分為3個組,分為完整皮膚組、破損皮膚組和對照組(空白軟膏組)。給藥前24 h,用納米速效脫毛膏將動物背部脊柱兩側的毛全部脫掉,SD大鼠去毛范圍單側約為3 cm×3 cm。脫毛后應檢查皮膚是否因去毛而受到損傷,受傷的皮膚不宜作完整皮膚的實驗。并用16號針頭劃“#”字作為標記,以滲血為度。將七白軟膏均勻涂布并固定24 h后去除殘留物,連續7 d觀察SD大鼠的表現和死亡的情況。

1.2.2 單次皮膚刺激性實驗 選取健康SD大鼠20只平均分為2組,即為完整皮膚組和破損皮膚組。同前方法用納米速效脫毛膏將動物背部脊柱兩側的毛全部脫掉。通過SD大鼠自身兩側皮膚進行對照,分別在同1只SD大鼠脊柱兩側皮膚涂敷七白軟膏和空白軟膏各1 g,并固定。涂藥6 h后去除殘余物質,并分別在去除藥物后的24 h、48 h和72 h肉眼觀察并記錄涂布部位有無紅斑和水腫等情況,進行皮膚刺激強度評價。

1.2.3 多次皮膚刺激性實驗 多次給藥試驗所應用的只數、分組和給藥劑量同單次給藥試驗一致。涂抹1次/d,1 g/次,持續時間1周。末次給藥24 h、48 h和72 h后用肉眼觀察并記錄涂布部位是否出現紅斑和水腫等現象,進行皮膚刺激強度評價。

1.2.4 眼部刺激性試驗 取健康的SD大鼠10只。試驗前24 h對每只受試SD大鼠的雙眼進行檢查。如若發現有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷或結膜損傷的SD大鼠不能用于試驗。試驗時慢慢拉開眼瞼,將0.1 g軟膏涂于SD大鼠一側的眼結膜囊內,另一側作為空白對照。給藥后把SD大鼠的眼睛被動閉合10 s。分別在給藥后的1、2、4、24、48、72 h對眼部進行檢查。

1.2.5 皮膚主動過敏致敏接觸試驗 選取健康的SD大鼠30只,雌雄各半,隨機分為3組,分別為七白散軟膏組、空白軟膏組和陽性對照組。選取2,4-二硝基氯代苯為陽性致敏物,試驗前配制成0.1%的激發濃度和1%的致敏濃度。選取受試藥物0.1 g涂布于同一SD大鼠的脫毛區,用適宜的方法固定。而另一側涂抹生理鹽水作為對照,連續作用6 h。分別在第7天和第14天,以同樣方法重復。空白軟膏組與陽性對照組方法同上。

1.2.6 皮膚主動過敏激發接觸試驗 健康的SD大鼠致敏14 d后,將受試藥物0.1 g涂布在同一SD大鼠背部的脫毛區,6 h后去掉受試藥物并觀察,分別在24、48、72 h后再次觀察皮膚的過敏反應情況,各組結果按照皮膚過敏反應評分表評分,并判斷其致敏率。出現皮膚紅斑或水腫的SD大鼠例數除以受試動物的總數為致敏率。

為了評價七白軟膏對動物皮膚用藥的安全性,我們進行了七白軟膏和空白基質對SD大鼠脫毛皮膚單次和多次涂藥的刺激性試驗。試驗的主要評價標準如下：紅斑評分標準:無紅斑為0,輕度紅斑(勉強可見)為1,中度紅斑(明顯可見)為2,重度紅斑為3,紫紅色紅斑到輕度結痂形成為4。水腫評分標準:無水腫為0,輕度水腫(勉強可見)為1,中度水腫(明顯可見)為2,重度水腫(皮膚隆起1 mm,輪廓清楚)為3,嚴重水腫(皮膚隆起1 mm以上,并有擴大或水泡、破漬)為4。皮膚刺激強度評價標準:0～0.49時為無刺激性;0.5～2.99時為輕度刺激性;3.0～5.99時為中度刺激性;6.0～8.0時為強度刺激性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析,組間比較采用單因素方差分析,組內用藥前后比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮膚急性毒性試驗 從去除受試物1 h后開始觀察持續7 d,SD大鼠的活動、覓食均正常,呼吸無異常反應。全身中毒反應及死亡的情況在受試SD大鼠身上均無發生,表明七白散軟膏外用無急性毒性反應。

表1 單次給藥完整皮膚刺激反應平均分值

表2 多次給藥完整皮膚刺激反應平均分值

表3 七白散軟膏對皮膚致敏反應的評分結果±s)

注:與七白散軟膏組對照組比較*P<0.01。

圖 1單次給藥對健康大鼠的影響

注：A空白軟膏;B七白散軟膏。

2.2 單次給藥皮膚刺激性試驗 單次給藥皮膚刺激強度評分見表1。完整皮膚組給予受試物1～72 h內均未出現紅斑或水腫現象。所有組別的平均反應分值均低于0.5分,表明受試物對正常皮膚及破損皮膚均無刺激性。受試物一次給藥對完整皮膚與破損皮膚刺激的平均反應分值差異無統計學意義。

2.3 多次給藥皮膚刺激性試驗 多次給藥皮膚刺激試驗結果見表2。完整皮膚組多次給予七白散軟膏和空白軟膏后,動物皮膚均無紅斑和水腫現象。其平均分值為0,表明受試物對大鼠完整皮膚無刺激性。破損皮膚組于給藥的第4天,其中一只大鼠皮膚均略見紅斑(分值為1),第5、6天程度略有加劇,并于給藥后第7天消退。連續給藥1周后,大鼠完整及破損皮膚均未見紅斑及水腫。破損皮膚組的傷口已逐漸愈合。根據皮膚刺激強度評分標準,本試驗結果的刺激指數<0.5,因此可以認為七白散軟膏多次給藥對皮膚無刺激性。

2.4 眼部刺激性試驗 于給藥1～72 h對眼部進行檢查,未發現大鼠角膜混濁、虹膜異常、結膜充血、水腫或產生分泌物等現象。根據眼部刺激強度評分標準,本實驗結果的刺激指數<0.5,表明七白散軟膏對大鼠無眼部刺激作用。

2.5 皮膚主動過敏試驗 激發接觸后觀察,2,4-二硝基氯苯陽性對照組在接觸和激發試驗中,所有的SD大鼠均出現不同程度的紅斑現象,輕度紅斑為2只,中度紅斑為6只,重度紅斑為2只,其中5只有輕度的水腫現象。七白散軟膏組和空白軟膏組在致敏接觸和激發接觸中均未出現任何的紅斑和水腫等皮膚過敏反應。按公式計算致敏反應的發生率:致敏反應發生率(%)=有過敏反應的只數(不論程度輕重)/動物總數 100%,可知陽性致敏物的致敏率為100%,即有極度致敏性;七白散軟膏和空白軟膏致敏率為0,即表示外用時不產生過敏反應。

圖2 2,4-二硝基氯代苯和七白散軟膏分別對大鼠的影響

注：A 2,4-二硝基氯代苯;B七白散軟膏。

3 討論

七白散軟膏作為一種傳統的中藥復方制劑,主要成分包括白術、白及、白茯苓、白僵蠶、白芷、白蒺藜和浙貝母[13]。由于傳統的中藥復方水煎劑,存在著制劑技術落后、制劑質量控制難,使用、攜帶、儲存不便等諸多缺點。隨著人們對健康的不斷重視,對依從性認識的不斷提高,傳統湯劑固有的某些性質已越來越不適應社會的醫療要求[14]。因此我們選擇了制備現代劑型軟膏劑[15],這種劑型具有易于涂布、方便攜帶、質量易控制、科技含量高等特點。本實驗結果表明,七白散軟膏通過皮膚急性毒性試驗、單次給藥刺激性試驗、多次給藥刺激性試驗、眼部刺激性試驗、皮膚主動過敏試驗對SD大鼠進行體外安全性考察,表明七白散軟膏無刺激性和過敏性,體外給藥安全可靠。具有良好的臨床應用前景。

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(2017-05-15收稿 責任編輯：王明)

Experimental Animal Study on Skin Toxicity of Qibai Powder Ointment

Zhang Qian, Xiong Yamin, Wang Rongshuai, Jiang Bo, Zhang Jinming

(FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective:To study the toxicity of Qibai Powder Ointment on animals. Methods:The safety of Qibai Powder Ointment for external use was evaluated with skin irritation scores as indicators through experiments on acute toxicity of Qibai Powder Ointment in SD rats, single or multiple dose active irritation, eye irritation and skin allergic test. Results:After single and multiple drug dose tests, no edema and erythema in SD rats with intact skin group appeared, but erythema appeared in SD rats with damaged skin group of both single and multiple dose and symptoms relieved after cease of the drug. Based on irritant of the skin scale, indexes of single and multiple dose tests were both less than 0.5, indicating that Qibai Powder Ointment on the skin has no irritation. Skin allergy tests showed that the positive allergic sensitization rate was 100%, that is to say, the extreme allergic. No allergic reaction such as erythema and edema appeared in both the Qibai Powder ointment group and blank ointment contrast group in allergenicity and irritant exposure tests and the allergenicity rate was 0. Conclusion:Through in vitro safety study, Qibai Powder Ointment on the skin irritation does not induce allergic reactions and without discomfort and it is safe and reliable as an ointment preparation for external use.

Qibai Powder; Acute toxicity; Irritant; Allergenicity

張倩(1986.07—),女,碩士研究生,住院醫師,研究方向:神經疾病康復,E-mail:zhangqian531@yeah.net

熊亞敏(1979.03—),女,碩士研究生,主治醫師,研究方向:神經疾病康復,E-mail:yayamin0000@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.07.037