自發性高血壓大鼠肝火亢盛證的認知功能變化

王 田 趙慧輝 鄧 冬 王宏亮 李雪麗 劉婧瑋 商曉迪 蔡榕琪 馬雪玲 王 偉

(北京中醫藥大學，北京，100029)

自發性高血壓大鼠肝火亢盛證的認知功能變化

王 田 趙慧輝 鄧 冬 王宏亮 李雪麗 劉婧瑋 商曉迪 蔡榕琪 馬雪玲 王 偉

(北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：評估自發性高血壓大鼠(SHR)肝火亢盛證的認知功能變化，為進一步深入研究高血壓認知功能改變的機制及中醫藥防治奠定基礎。方法：采用經典Morris水迷宮和跳臺實驗，評估肝火亢盛證SHR大鼠的認知功能變化，對照組采用WKY大鼠和Wistar大鼠2種。結果：Morris水迷宮空間探索實驗中，穿越平臺次數肝火亢盛證SHR大鼠明顯少于Wistar組(P<0.05)。跳臺實驗中，肝火亢盛證SHR大鼠跳上時間明顯較WKY組延長(P<0.05)，潛伏期則較WKY對照組明顯縮短(P<0.05)，錯誤次數較WKY組及Wistar顯著增多(P<0.05)。結論：肝火亢盛證SHR大鼠的學習認知功能較WKY及Wistar對照組下降，主要表現為注意力和學習效率下降，受到緊張、憤怒等情緒刺激時判斷力下降，且注意力和學習效率下降更為明顯。

自發性高血壓大鼠；肝火亢盛證；認知功能；情緒

高血壓是目前臨床最為常見的慢性病之一，與心腦血管疾病顯著相關，并與認知功能存在密切相關[1]。有研究表明[2]，中年期高血壓與認知功能障礙存在關系，而中年期高血壓及病程5年以下的高血壓患者中醫證型以肝火亢盛為主[2]，肝火亢盛作為高血壓早期最常見的證型[3]，研究其認知功能變化對于早期防治高血壓患者認知功能減退具有重要意義。病證結合動物模型是臨床研究與基礎研究的重要橋梁，課題組前期研究顯示，14～18周齡的自發性高血壓大鼠(SHR)表現為穩定的肝火亢盛證[4]。因此本研究采用高血壓肝火亢盛證大鼠模型評估高血壓對認知功能的影響，為今后進一步深入研究高血壓肝火亢盛證認知功能改變的機制及中醫藥防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 14周齡,雄性，清潔級(北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012-0001)SHR大鼠20只作為觀察組，適應性喂養1周后，于15周齡測量血壓基線、采集宏觀表征和行為學試驗，根據課題前期實驗確立的證候屬性判別方法[5]，進行證候屬性辨識，篩選符合肝火亢盛證診斷標準的SHR大鼠15只，作為肝火亢盛證模型組。同周齡WKY和Wistar大鼠各15只作為正常對照組，飼養于北京中醫藥大學科研中心動物室，12 h光照與黑暗交替，定期進行紫外消毒排風，自由飲水攝食，常規飼料喂養。

1.2 儀器 SoftronBP-98A大鼠無創尾動脈測壓儀(北京軟隆科技有限責任公司)，Morris水迷宮及鼠博士RD1101-MWM Morris水迷宮視頻分析系統(上海移數信息科技有限公司)，跳臺記錄儀YLS-3TB(北京冀諾泰科技發展有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 尾動脈收縮壓測量 采用Softron大鼠無創尾動脈測壓儀測量安靜狀態下大鼠血壓。測量前將儀器連接好，開啟熱泵，溫度控制在38～40 ℃，大鼠用固定器固定好并置于儀器中，平均每只預熱5～10 min，嚴格按照儀器操作說明書規范操作，準確測量大鼠安靜清醒狀態尾壓，連續測量多次，取其中3次上下差值小于5的結果，求均值。

1.3.2 易激惹程度分級及評分 參照文獻[6]分級方法:Ⅰ級：指捉持頸部時出現尖叫、驚跳(記1分);Ⅱ級：指捉持頸部時欲咬人或咬人(記2分);Ⅲ級：指提拿尾部時即出現尖叫、驚跳甚至咬人或與同籠大鼠頻繁打斗(記3分);無上述情況者為0級(記0分)。

1.3.3 Morris水迷宮實驗 水迷宮實驗裝置為一個直徑120 cm,高50 cm的圓形水池，分成4個象限,分別標記4個不同的入水點。實驗室保持室內參照物環境不變，通過自動圖像拍攝系統記錄游泳軌跡。

1.3.4 定位航行實驗 在其中一個象限放置一個高30 cm,直徑10 cm的透明圓形平臺,水池中添加25 ℃左右的溫水直至高于平臺2 cm。先把大鼠放在平臺上停留30 s熟悉環境,然后每次隨機從其中一個入水點面朝池壁放入水池中。計算機自動跟蹤大鼠游泳軌跡并記錄找到平臺的時間，即逃避潛伏期，訓練時間為60 s，如在記錄時間內大鼠未能找到平臺，則協助大鼠找到平臺并允許其在平臺上停留30 s以建立空間記憶，然后將動物移開，擦干，減少寒冷對大鼠的刺激以減少對證候表征的影響。每天測試4次,分別從4個不同入水點放入水中，取其平均值，連續訓練4 d。

1.3.5 空間探索實驗 最后一次定位航行實驗結束后第2天，將平臺撤除，開始60 s的探查訓練，將動物由原先平臺象限的對側放入水中，記錄動物在目標象限停留的時間和穿過平臺的次數，以此作為空間記憶的檢測指標。實驗原始錄像數據應用水迷宮自帶軟件進行分析整理。

1.3.6 跳臺實驗 跳臺實驗裝置為一長方形反射箱，其長徑被黑色塑料板隔為若干區間，底部鋪以間距為5 mm的銅柵，可通適當的電流；每個小的區間有一個高3 cm和直徑為10 cm的小平臺。實驗時，將大鼠放入反射箱內適應環境30 s，然后通以交流電，受到電擊后，其正常反應是躲避電擊跳上平臺，大多鼠有可能再次或多次跳下平臺受到電擊，受到電擊時又會迅速跳回平臺。如此訓練5 min，并記錄每只大鼠第1次跳上平臺的時間和受到電擊的次數(錯誤次數)，以此為學習成績。24 h后重新測驗，此次測驗時，首先將鼠放在平臺上，記錄第1次跳下的時間(潛伏期)和3 min內的錯誤次數，測驗時若大鼠停留在平臺的時間超過3 min，其潛伏期以3 min計，以此反映記憶保持情況。記錄、比較不同組間大鼠記憶成績的差異。

2 結果

2.1 尾動脈收縮壓的測量結果 肝火亢盛證SHR組大鼠血壓明顯升高，血壓顯著高與WKY組和Wistar組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，WKY組與Wistar組血壓則差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 3組大鼠血壓結果

注：與WKY組比較，*P<0.05；與Wistar組比較，△P<0.05。

2.2 易激惹程度評分結果 肝火亢盛證SHR大鼠易激惹評分明顯升高，顯著高于WKY對照組和Wistar對照組(P<0.05)，Wistar大鼠評分略低于WKY大鼠，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 水迷宮實驗結果

表2 各組大鼠易激惹程度評分結果(分，±s)

注：與WKY組比較，*P<0.05；與Wistar組比較，△P<0.05。

2.3.1 逃避潛伏期結果 前兩天逃避潛伏期結果，SHR肝火亢盛證的逃避潛伏期明顯短于Wistar組(P<0.05),但隨著訓練次數增加，第3、4天兩者差異無統計學意義(P>0.05)。在水迷宮實驗中，WKY對照組表現出了明顯的漂浮傾向，潛伏期隨訓練次數呈增長趨勢，逃避潛伏期明顯較SHR組及Wistar組大鼠延長(P<0.05)。見表3。

2.3.2 目標象限停留時間和穿越平臺次數結果 肝火亢盛證SHR組大鼠較Wistar組目標象限停留時間較短，但兩者差異并無統計學意義(P>0.05),而WKY組的目標象限停留時間明顯短于肝火亢盛證SHR組大鼠和Wistar組(P<0.05)。肝火亢盛證SHR組大鼠及WKY組的穿越平臺次數明顯少于Wistar組(P<0.05)，WKY組略少于肝火亢盛證SHR組大鼠，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 跳臺實驗結果 與WKY組大鼠比較，SHR組大鼠跳上時間明顯延長、潛伏期明顯縮短、錯誤次數明顯增加(P<0.05)；與Wistar大鼠比較，SHR肝火亢盛證大鼠跳上時間延長、錯誤次數增加(P<0.05)，而WKY組與Wistar組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

3 討論

肝火亢盛證主要由于肝失疏泄，氣郁化火，陽亢火升，上擾頭竅所致，高血壓肝火亢盛證多表現于高血壓的早期和中期，多分布在高血壓分期Ⅰ期、Ⅱ期[7-9]，且多發生于55歲以下患者[3,7]，且多表現出急躁、易怒等肝火旺盛之相。肝火亢盛證SHR大鼠與肝火亢盛證高血壓患者相似，表現出急躁、易怒等特征，易激惹評分明顯升高(P<0.05)。在被電擊的跳臺實驗中，第1次跳上時間顯著長于WKY對照組，可能由于收到電擊產生緊張、憤怒情緒，判斷力下降，學習效率降低，難以找到平臺以及學會利用平臺躲避點擊，與Wistar大鼠比較雖然時間更長但差異無統計學意義，原因考慮樣本量不足或學習能力雖有下降但不嚴重。第2天測試期錯誤次數明顯多于兩對照組，可能說明記憶略差于正常對照組或注意力下降、耐心不足，潛伏期也較WKY對照組明顯縮短，雖然與Wistar對照組差異無統計學意義(P>0.05)，但數值差異巨大，導致這種情況的原因我們認為：1)是大鼠個體差異較大，樣本量不足；2)是測試時間可以延長至5 min，這樣組間差異能體現的更明顯。

目前Morris水迷宮實驗在國內外已得到普遍認可，成為應用最廣泛的研究和評價動物空間學習記憶能力的經典行為學實驗[10]。目前在高血壓動物實驗中，主要以WKY大鼠作為SHR大鼠的對照組，但在Morris水迷宮實驗中，許多研究表明WKY大鼠有一定的抑郁癥傾向，現已被作為難治性抑郁癥的動物模型[11]，會表現出明顯的漂浮傾向，我們的實驗中也說明了這一點，第1天實驗時WKY訓練潛伏期明顯短于Wistar大鼠，但SHR與Wistar大鼠隨訓練次數增加，建立了空間記憶，訓練潛伏期日漸縮短，而WKY大鼠則漂浮傾向日益嚴重，潛伏期呈上升趨勢，故不適宜作為水迷宮實驗的對照組。由于肝火亢盛證SHR大鼠的急躁、多動、活動性增加等特征，在水迷宮實驗的前兩天，找到平臺的時間(潛伏期)明顯短于Wistar大鼠(P<0.05)，第3、第4天則差異無統計學意義(P>0.05)。且Wistar大鼠潛伏期明顯縮短是在訓練期的第3天，而肝火亢盛證SHR大鼠潛伏期明顯縮短則在訓練期的第四天，說明肝火亢盛證SHR大鼠的學習效率略低于Wistar組。穿越平臺次數Wistar大鼠顯著多于肝火亢盛證SHR大鼠(P<0.05)，可能說明肝火亢盛證SHR大鼠的空間記憶略差于Wistar大鼠。以上結果說明，在避免了電擊這種較易引起緊張、憤怒等情緒變化的刺激時，SHR大鼠的記憶表現在潛伏期、目標象限停留時間等方面與對照組差異并不大，說明早期高血壓肝火亢盛證對學習記憶影響雖有但比較小，結合跳臺實驗結果，說明肝火亢盛證高血壓引起的認知功能變化以注意力下降和學習效率降低為主，在受到緊張、易怒等情緒影響時則出現判斷力下降，且注意力和學習效率下降更為明顯。

表3 2組大鼠水迷宮訓練潛伏期、目標象限停留時間和穿越平臺次數±s)

注：與WKY組比較,*P<0.05;與Wistar組比較,△P<0.05。

表4 2組大鼠跳上時間、基礎錯誤次數、潛伏期和錯誤次數±s)

注：與WKY組比較，*P<0.05；與Wistar組比較，△P<0.05。

而近年來研究表明，高血壓患者在合并腦卒中之前就可能有不同程度的認知損害，且有研究表明[11]，中年期高血壓患者就已經出現認知功能減退，且與收縮壓呈正相關性。Stewart等[12]的研究發現，中年期的血壓會對老年期的認知功能有不利影響。Suhr等[13]對20～59歲人群的血壓與認知功能的關系進行研究，結果顯示收縮壓與注意力和學習效率呈負相關，且對于<40歲的研究對象，血壓升高與認知得分減低的相關性更為明顯。趙君玫等[14]則發現，單純憤怒應激即可使大鼠的認知功能下降。

本研究發現在自發性高血壓大鼠早期的肝火亢盛證時期，發生認知功能的下降，與上述研究結果基本一致，且肝火亢盛證高血壓大鼠認知功能的下降更易受憤怒等情緒的影響，關于其認知功能下降的機制有待今后進一步深入研究，積極探索高血壓認知功能改變的早期預防和治療方法。

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(2017-05-03收稿 責任編輯：楊覺雄)

Research on the Cognitive Function of Spontaneously Hypertensive Rats of Liver-fire Hyperactivity Type

Wang Tian,Zhao Huihui,Deng Dong,Wang Hongliang,Li Xueli，Liu Jingwei,Shang Xiaodi,Cai Rongqi,Ma Xueling,Wang Wei

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To evaluate the cognitive function of spontaneously hypertensive rats (SHR) of liver-fire hyperactivity type，thus laying the foundation for further research on the mechanism of the cognitive function changes as well as the prevention and treatment of traditional Chinese medicine.Methods:Using the method of classical Morris water maze and step-down test to evaluate the changes of cognitive function of liver-fire hyperactivity SHR rats.The control group use WKY and Wistar rats.Results:In the morris water maze spatial probe test,the time of crossing the platform of liver-fire hyperactivity SHR rats was significantly reduced than that of the control group (WistarP<0.05).In the step-down test,the reaction time of liver-fire hyperactivity in SHR rats was significantly longer than that of WKY control group (P<0.05),and the latency of liver-fire hyperactivity SHR is significantly shortened than that of WKY control group (P<0.05).Besides,the frequency of mistakes of liver-fire hyperactivity SHR were significantly increased than that of WKY and Wistar control group (P<0.05).Conclusion:Cognitive function of liver-fire hyperactivity in SHR decreased compared with WKY and Wistar control group,mainly manifested as decreased of attention and learning efficiency.When SHR rats were affected by emotions such as tension and anger,the judgment of SHR decreased significantly,and the decrease of attention and learning efficiency was more obvious.

Spontaneously hypertensive rats; Liver-fire hyperactivity syndrome; Cognitive function; Emotion

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目資助(2011CB505106);國家自然科學基金青年項目(81503382);國家自然基金面上項目(81473521);北京中醫藥大學中青年教師項目(面上項目)(2015-JYB-JSMS036)

王田(1991.03—)，女，碩士，研究方向：心血管病癥結合動物模型，E-mail：wagtinna@bucm.edu.cn

王偉(1964.09—)，男，博士，研究員，博士研究生導師，研究方向：心血管方向，E-mail：wangwei@bucm.edu.cn;馬雪玲(1983.11—)，女，博士，講師，研究方向：心血管應用基礎研究及中醫護理，E-mail：maxueling@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.07.038