昆明市區虎皮鸚鵡源大腸桿菌毒力基因及耐藥基因的流行病學特征

楊 娟，吳海濱，戴開娜，魏學林，吳培福

(1．西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224;2．大寨鄉人民政府畜牧獸醫站，云南 金平 661511)

昆明市區虎皮鸚鵡源大腸桿菌毒力基因及耐藥基因的流行病學特征

楊 娟1，吳海濱1，戴開娜2，魏學林1，吳培福1

(1．西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224;2．大寨鄉人民政府畜牧獸醫站，云南 金平 661511)

為研究大腸桿菌毒力基因和耐藥基因的流行病學特征對大腸桿菌病的防控，從昆明市花鳥市場采集虎皮鸚鵡糞樣，從中分離鑒定大腸桿菌，并對12種毒力基因及22種耐藥基因的攜帶情況進行了檢測。結果從虎皮鸚鵡糞樣中共分離鑒定出47株大腸桿菌;feo B、tra T、fim A基因攜帶率都為100%;不攜帶cva C基因。41．67%的毒力基因檢出率在50%以上。對耐藥基因而言，除氨基糖苷類藥物的aac(3)－Ia基因、β－內酰胺類藥物的OXA、SHV基因未檢出外，其余耐藥基因均呈陽性。試驗結果可為虎皮鸚鵡大腸桿菌病的預防提供理論支持和實踐借鑒。

虎皮鸚鵡;大腸桿菌;毒力基因;耐藥基因

大腸桿菌病是一種全世界范圍內流行的人獸共患病之一，具有廣泛傳播性和重要的公共衛生學意義。大腸桿菌的致病性和耐藥性分別與其攜帶毒力基因和耐藥基因的種類、數目存在相關性［1，12］?；⑵W鵡作為觀賞鳥類，在全世界分布廣泛，同樣亦對致病性大腸桿菌敏感［2－4］，特別是幼齡鸚鵡感染性更高，但目前很少見到虎皮鸚鵡糞便大腸桿菌毒力基因及耐藥的研究報道。因此，本試驗在分離鑒定虎皮鸚鵡糞便大腸桿菌的基礎上，對分離株毒力基因的流行病學特征及耐藥基因攜帶率進行研究，可為大腸桿菌病的防控提供理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料 虎皮鸚鵡(2016年6～7月采集于昆明市4個市區7個花鳥市場，共83個糞樣);LB固體培養基、伊紅美藍培養基、蛋白胨、酵母粉，均購自昆明碩陽科技有限公司。

1.2 大腸桿菌平板菌落計數 稱取0．1 g虎皮鸚鵡糞樣于 PE管中，用蛋白胨緩沖液進行10－4～10－6倍稀釋，取20μL接種于伊紅美藍培養基上培養18～24 h后進行平板菌落計數。

1.3 大腸桿菌分離與鑒定 本研究用伊紅美藍培養基初步篩選大腸桿菌，后利用生化試驗和PCR技術進一步鑒定大腸桿菌。PCR鑒定(Uid和16S rRNA基因)所用引物參見文獻［5－6］。生化試驗包括:糖發酵試驗(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、明膠液化試驗、硫化氫試驗、吲哚(靛基質)試驗、甲基紅(M.R.)試驗、V－P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、尿酶試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗。

1.4 毒力基因及耐藥基因的擴增 通過全菌裂解法提取大腸桿菌基因組DNA，并對12種毒力基因的流行情況和22個耐藥基因攜帶情況進行檢測。12種毒力基因包括:feo B、tra T、fim A、fyu A、irp－2、ro N、iuc C、tsh、iut A、iss、cva C和pap C，其擴增引物及參數參考文獻［1］;22種耐藥基因包括:磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3);四環素類耐藥基因(tet A、tet B);氨基糖苷類耐藥基因［aac C2、aac C4、aad Al、aad A2、aac(3)－Ia、aac(3)－IIa、aph(3)－IIa］;氯霉素類耐藥基因(Catl、Cml A、Flor);β-內酰胺類耐藥基因包括(CTX－M、SHV、OXA、TEM);喹諾酮類基因包括Qnr S;其他基因Gyra(QRDR)、Aac(6')-Ibcr。擴增引物及參數參考文獻［7］。引物由鉑尚生物技術有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 虎皮鸚鵡糞便大腸桿菌活菌計數 從每個區花鳥市場采集虎皮鸚鵡糞樣，用伊紅美藍培養基進行平板菌落計數，得出:盤龍區、五華區、西山區、官渡區虎皮鸚鵡糞便中大腸桿菌平均數分別為: 1.61×108CFU/g、4.90×108CFU/g、2.03×106CFU/g、3．78×108CFU/g。從中可以看出，五華區虎皮鸚鵡糞便中大腸桿菌數最多，西山區最少。

2.2 大腸桿菌分離鑒定 本試驗總共分離到71株細菌，最終鑒定出47株大腸桿菌，檢出率為66.20%。分離的大腸桿菌在伊紅美藍培養基上為黑色帶金屬光澤的菌落;革蘭染色均為陰性，生化鑒定為:能發酵蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖產酸產氣，能利用硝酸鹽，不產生硫化氫，不分解尿素和淀粉，不液化明膠，M.R.和吲哚呈陽性，V－P試驗和枸櫞酸鹽利用試驗為陰性，均符合大腸桿菌的生化特性。大腸桿菌兩種基因的PCR鑒定均為陽性，條帶大小與預計大小一致。

2.3 大腸桿菌毒力基因分布 本試驗對47株大腸桿菌12個毒力基因進行檢測，結果見表1。feo B、tra T及fim A基因檢出率都為100%;未檢出cva C基因。41．67%的毒力基因檢出率在50%以上。

表1 大腸桿菌相關毒力基因的分布

2.4 毒力基因數量分布情況 本試驗中每株大腸桿菌同時攜帶不少于3種毒力基因，20株同時攜帶7～9種毒力基因。9株同時攜帶6種毒力基因，攜帶率最高(19．15%)(見表2)。

在HPI強毒力島標志基因方面，fyu A+irp－2的檢出率為31．92%。3株同時攜帶 iss、irp－2、pap C、tsh 4種毒力基因。27株至少含有2種以下毒力基因:iut A、iss、tsh、iro N、irp－2。

表2 毒力基因數量分布情況

2.5 虎皮鸚鵡腸道大腸桿菌耐藥基因檢測 采用已建立的PCR方法，對47株E．coli分離株進行22種耐藥基因的檢測(見表3)。Qnr S的檢出率最高(100%);aac(3)－Ia、OXA和SHV基因均未檢出。在耐磺胺類藥物的基因中，sul2基因的檢出率最高(80．85%);四環素類藥物以tet A基因的檢出率最高，為74．67%;氨基糖苷類以aad Al基因的檢出率最高，為63．83%;氯霉素類以Catl基因的檢出率最高，為97．87%;β－內酰胺類以TEM基因的檢出率最高，為89．36%。

本試驗中，分離株均攜帶5種以上耐藥基因，最大攜帶量為17，46株攜帶耐藥基因的量在8種以上，占全部菌株的97．87%。

表3 耐藥基因檢率

3 討論

3.1 大腸桿菌菌落計數及鑒定 試驗結果表明，昆明市五華區鸚鵡腸道糞便中大腸桿菌的菌落數最高，西山區最低，這可能與動物的飼養環境、食物種類、衛生狀況等因素有關。五華區花鳥市場屬于昆明市較大的花鳥市場，動物種類多，客流量大，可能會促進大腸桿菌的傳播。西山區動物種類較少，偏向于花卉貿易，降低了大腸桿菌的傳播幾率。

本試驗總共分離出71株細菌，最終鑒定出47株大腸桿菌。研究結合分離株的菌落特征、生化特征及PCR技術來鑒定大腸桿菌，因而，大腸桿菌的鑒定結果較可靠，滿足后續試驗的要求。

3.2 大腸桿菌毒力基因與耐藥基因的流行特征研究表明，大腸桿菌致病性與所其攜帶的毒力基因密切相關［8］，涉及的基因主要有 iut A、tsh、iro N、cva C、ast A、iss、irp2、pap C、iuc D、vat等。董向磊研究認為，在iut A、iss、tsh、iro N、irp－2、cva C 6種毒力基因中，如果APEC分離株同時攜帶有2種以上毒力基因，則有89．74%的概率認定該分離株具有致病性，誤差率為7．90%［1］。為此，本文研究了鸚鵡源大腸桿菌毒力基因的流行特征。以往研究［9－12］對APEC的毒力基因進行了檢測，認為耶爾森菌強毒力島(HPI)攝鐵系統與致病性密切相關，是決定細菌的致病性重要的原因之一，irp2和fyu A是HPI的核心基因。本試驗中毒力基因的檢出率均明顯低于以往的報道，說明多數分離株的致病性可能較弱或沒有致病性。在以往試驗中，研究菌株分離自發病禽類，而本試驗糞樣來自于非發病禽，因而毒力基因檢出率偏低，但并不能說明鸚鵡不攜帶致病性菌株，某些菌株攜帶毒力基因的種類較多(如4株分離株同時攜帶有 iut A、iss、tsh、iro N和irp－2基因)，具有一定的潛在致病性，因而，在鸚鵡大腸桿菌病的防治過程中不容忽視，特別是在環境復雜的花鳥市場應加強衛生管理。

隨著抗生素的應用，大腸桿菌耐藥性日益嚴重，且其耐藥譜不斷增寬。大腸桿菌耐藥性與其耐藥基因的攜帶率有明顯的相關性，為此，耐藥基因的檢測對生產實踐有重要的指導意義。在本試驗中，分離株耐藥基因的攜帶率比張濟培［14］和張忠［7］的報道偏高，這可能與飼料中抗生素殘留和濫用抗生素有關。

綜上所述，昆明市區花鳥市場糞便大腸桿菌毒力基因攜帶率低，但耐藥基因的攜帶率較高。然而，虎皮鸚鵡是目前常見的寵物鳥之一，與人類接觸頻繁，大腸桿菌的毒力基因與耐藥基因很可能傳播到人類。本論文試驗結果可為虎皮鸚鵡大腸桿菌病的預防提供理論支持和實踐借鑒。

［1］ 董向磊．禽致病性大腸桿菌的分離鑒定和分離株毒力基因與致病性相關性研究［D］．揚州:揚州大學，2014．

［2］ 劉亞梅，畢暉，馬軍，等．淺述鸚鵡大腸桿菌病的診斷和防治［J］．吉林畜牧獸醫，2009，30(7):14．

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S852.61+2

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0529-6005(2017)06-0100-03

2016-09-01

云南省優勢特色重點學科生物學建設項目(50097505);云南省高校林下生物資源保護及利用科技創新團隊(51400605);西南林業大學科技創新基金(15108)

楊娟(1992-)，女，碩士生，研究方向為動物疫源疫病，E-mail:m18788189620@163．com

吳培福，E-mail:jed－wu2008@126．com