DNA條形碼在新型毒品原植物恰特草種屬鑒定中的應用研究

申鈺柯 劉陳業 周 旦 陳鵬升 陳云霞

DNA條形碼在新型毒品原植物恰特草種屬鑒定中的應用研究

申鈺柯 劉陳業 周 旦 陳鵬升 陳云霞

毒品原植物是指用來提煉、加工成鴉片、海洛因、甲基苯丙胺、嗎啡等麻醉藥物和精神藥物的原植物。其中罌粟、古柯、大麻被稱為世界三大毒品原植物。恰特草作為一種新型毒品原植物近兩年被大量走私入境。

恰特草（Catha edulis），又名：巧茶、也門茶、阿拉伯茶、埃塞俄比亞茶等，屬衛矛科（Celastraceae）巧茶屬（Catha）植物，產于東非和阿拉伯半島等地區。其含興奮化學物質卡西酮，對人體中樞神經具有刺激作用，長期嚼食會染癖成癮，又被稱為“東非罌粟”，具有嚴重的社會危害性。世界衛生組織將恰特草歸類為Ⅱ類軟性毒品。很多國家已將其列為興奮劑或受管制藥物，嚴禁旅客攜帶或郵寄入境。

2014年，恰特草已列入《精神藥品品種目錄（2013版）》，被視為第一類精神藥品，在我國毒品打擊范圍之內，凡種植、持有、販賣、走私、服食恰特草均屬違法犯罪行為。

恰特草作為一種新型的毒品原植物，其經烘炒后的枝葉，外形酷似茶葉，形態上具有很高的偽裝性。一些不法分子在高額利潤的驅使下鋌而走險進行非法走私與貿易。而目前，恰特草的鑒定依然是依靠傳統的形態識別，但是對于一些形態特征被破壞，外觀不完整的檢材并不適用，具有一定的局限性，同時對案件的辦理也造成了一定阻礙。除此之外，傳統的形態識別法主要依靠鑒定人的經驗，對鑒定人的專業知識要求較高，在無法使用傳統的形態特征鑒定時，就需要依靠一些不依賴于形態特征的新技術、新方法進行識別鑒定。

近年來，DNA分子技術被廣泛應用到植物樣本的檢驗，使一些微量植物物證也能進行種類鑒定或是個體識別。并且，多種手段聯合應用于植物物證的檢驗將成為一種新的發展趨勢。國內對于毒品原植物的分子鑒定技術已經有一定的研究，但對于新型毒品恰特草的分子鑒定技術研究還是空白。本研究致力于對恰特草的DNA分子鑒定技術進行探索，以期建立從DNA提取、條形碼片段擴增到數據分析的恰特草分子鑒定體系，同時初步建立恰特草的DNA條形碼數據庫，實現恰特草的快速準確鑒定，為此類毒品案件的打擊提供技術支持。

一、材料與方法

（一）材料

恰特草新鮮植株由廣州海關緝私局提供（圖1-A），-20℃保存于國家林業局森林公安司法鑒定中心分子實驗室；經烘炒處理過的茶葉狀恰特草葉片由南京海關緝私局提供（圖1-B），常溫保存于國家林業局森林公安司法鑒定中心植物實驗室。

圖1 供試材料

（二）方法

1.總DNA的提取

分別取新鮮及烘炒處理的恰特草葉、莖各50mg，液氮速凍，用冷凍研磨儀研磨1min，分別用國產DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）及進口的DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取恰特草基因組DNA。DNA的質量采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

2.PCR擴增及測序

以恰特草DNA為模板，分別用引物rbcL- F（5'- ATGTCACCACAAACAGAAAC-3'）、rbcL-R（5'-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3'），trnL-F-F（5'-TTTGAACTGGTGACACGAG-3'）、trnLF-R（5'-GGTTCAAGTCCCTCTATCCC-3'），擴增葉綠體rbcL及trnL-F基因序列。

PCR反應在Biometra公司PCR儀上進行。反應體系為：2.5μL buffer，2μL dNTPs，2μL MgCl2，0.5μL primer-F，0.5 μL primer-R，2 μL DNA，0.2μL Ex-Taq，15.3μL MiliQ H2O。反應程序為：首先94℃預變性5min，然后每個循環94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，進行38個循環，最后72℃延伸10min。

PCR反應結束后，擴增產物送華大基因進行測序，測序引物即為擴增引物。為保證所測序列的準確性，對rbcL及trnLF序列進行雙向測序。

3.序列分析

對測定的核苷酸序列進行序列分析。序列的拼接校準使用DNASTAR軟件進行；序列相似性用NCBI的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行分析。

二、結果與分析

（一）提取效果檢測與分析

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，1-3號均在2000bp以上出現完整的條帶（圖2-A），表明在新鮮的恰特草組織中提取到了基因組DNA，但1號與3號樣均有一定的拖帶，說明DNA有一定降解，質量不高；2號樣的質量相對較好。4號未出現相應的條帶，并未提取到基因組DNA（見圖3），說明經烘炒處理過的恰特草葉片中DNA可能已嚴重降解。通過進一步的PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳驗證，1-3號DNA都可用來開展下一步實驗（圖2-B）。

（二）rbcL及trnL-F序列片段的獲得及分析

以恰特草基因組DNA為模板，利用rbcL引物進行PCR擴增，從中獲得725bp rbcL片段序列（基因登錄號：KX377452）；利用trnL-F引物進行PCR擴增，從中獲得453bp trnL-F片段序列（基因登錄號：KX377451）。將其在 NCBI上進行BLAST相似性檢索，均與衛矛科植物具有一定相似性。但也通過檢索與研究發現，GenBank中恰特草的DNA條形碼數據仍是空白。

三、討論

（一）恰特草DNA提取方法

新鮮的恰特草植株由于其葉和莖的細胞、形成層細胞分裂旺盛，代謝過程活躍，物質合成迅速，因此新鮮的恰特草植株的細胞中DNA含量很高，這個比較有利于DNA的提取。本研究用國產DNA試劑盒（TIANGEN公司）成功地從新鮮的恰特草植株的莖細胞中抽提出了恰特草DNA。

但目前各地公安機關和各海關部門送檢的恰特草多為經處理烘炒過的檢材。經多次重復實驗，發現國產DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）無法從處理過的恰特草中提取到可用以進一步PCR擴增的基因組DNA。主要原因有：①經烘炒處理過的恰特草由于受到高溫處理致使DNA發生降解。②國產DNA試劑盒（TIANGEN公司）提取DNA精度較差，尤其對于一些微量DNA的提取效果不佳。

本研究通過使用進口DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）成功地從經烘炒處理過的恰特草樣本的莖中提取出了較高質量的DNA。這表明進口DNA試劑盒提取DNA精度較高，適用于物證鑒定中提取經烘炒處理過的恰特草樣本DNA。

（二）經烘炒處理過的恰特草不同部位DNA降解程度不同

通過使用DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取經烘炒處理過的恰特草樣本的莖和葉片組織發現，從莖的組織中能成功提取較高質量的基因組DNA，并且能夠用于進一步的PCR擴增，而葉片組織無法提取到可用于擴增的DNA。這說明在經烘炒處理過后，恰特草的葉片和莖中的基因組DNA發生了不同程度的降解[10]，但是莖中的DNA降解程度要明顯低于葉片的降解程度。將此研究結論應用于鑒定過程中，在鑒定經烘炒處理過的恰特草檢材時，應盡量選取莖部位的恰特草檢材，由于莖中的DNA降解程度相對葉片較低，這樣更有利于提取恰特草DNA。但由于實驗材料的限制，該實驗僅針對一批烘炒處理的恰特草樣本進行了DNA提取實驗，或許不同批次材料處理程度不一樣，其中的DNA降解程度就不同，所以結論還需進一步論證確實。該部分研究結論僅供參考。

圖2 DNA檢測

（三）初步建立恰特草DNA條形碼數據庫

GenBank是美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）建立的DNA序列數據庫。GenBank也是目前全球公用的最具權威性、使用最頻繁的DNA序列數據庫。將研究獲得的恰特草核苷酸序列在GenBank中進行檢索比對，只與衛矛科的其他植物具有一定相似性，并未有相似程度高的物種。說明研究獲得的序列無誤，并非其他科屬植物，但也說明一點，目前GenBank中仍缺少恰特草DNA條形碼rbcL與trnL-F序列片段。將獲得的恰特草核苷酸序列上傳到GenBank中，獲取恰特草rbcL的基因登錄號（KX377452）與trnL-F的基因登錄號（KX377451）。

近年來，國家林業局森林公安司法鑒定中心也建立了毒品原植物的DNA條形碼數據庫。通過本研究獲得的恰特草DNA條形碼序列，也豐富與充實了國家林業局森林公安司法鑒定中心毒品原植物的DNA條形碼數據庫。對于打擊近年來走私恰特草案件是具有現實意義，也拓寬了毒品原植物分子鑒定領域的研究。

（四）DNA條形碼鑒定技術在恰特草實際鑒定中的應用

2016年5月，也門籍犯罪嫌疑人瑪某乘坐某航班，從廣州白云機場口岸入境。經查驗，在其行李箱內查獲用綠色塑料袋包裹的植物枝葉碎片，凈重78312.4g。廣州海關緝私局為了查明這起“行李箱藏匿疑似恰特草”案，委托國家林業局森林公安司法鑒定中心對涉案的植物進行種屬鑒定。但是該涉案植物檢材均為植物枝葉碎片，已無法使用形態特征進行識別鑒定。針對該檢材，使用該論文改良的基因組DNA提取法均成功提取到DNA，并通過與該研究建立的DNA條形碼序列數據庫進行序列比對，送檢的3份涉案檢材（圖3）均為恰特草所有，成功進行了種屬鑒定。

圖3 廣州海關緝私局送檢疑似恰特草枝葉碎片

本文系南京森林警察學院大學生創新創業訓練計劃項目（（201612213007）成果

（作者單位 南京森林警察學院）

（責任編輯 劉允杰）