利用餐廚垃圾滲濾液培養蘇云金芽孢桿菌

申麗君，段冉冉，張志強，許倩倩，呂 樂，劉曉璐，尹春華，張海洋，閆 海*

(1.北京科技大學化學與生物工程學院，北京 100083；2.北京綠色空間生物科技股份有限公司，北京 100097)

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利用餐廚垃圾滲濾液培養蘇云金芽孢桿菌

申麗君1，段冉冉1，張志強2，許倩倩1，呂 樂1，劉曉璐1，尹春華1，張海洋1，閆 海1*

(1.北京科技大學化學與生物工程學院，北京 100083；2.北京綠色空間生物科技股份有限公司，北京 100097)

以餐廚垃圾滲濾液為培養基，研究了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)的培養條件及其去除餐廚垃圾滲濾液中主要營養成分的優化控制條件。結果表明，當餐廚垃圾滲濾液體積分數在25%～100%范圍內時，隨餐廚垃圾滲濾液體積分數的增大，Bt生物量增大，Bt菌落形成單位升高，72 h達到4.5×107CFU·mL-1，對餐廚垃圾滲濾液中總有機碳(TOC)和總氮(TN)的去除率分別達到48.8%和52.4%。在餐廚垃圾滲濾液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4分別作為磷源和硫源，可以促進Bt的生長，72 h菌落形成單位達到1.4×108CFU·mL-1。表明利用餐廚垃圾滲濾液可以高效培養生物農藥Bt，是廢棄物高效資源化利用的有效途徑，具有重要的應用價值。

蘇云金芽孢桿菌；餐廚垃圾滲濾液；培養；處理

隨著我國經濟的快速發展和人們生活水平的提高，餐廚垃圾不斷增加。餐廚垃圾中含有75%～ 90%的水分，成分復雜，易腐敗并滋生細菌，如不進行處理，不僅污染環境，還嚴重威脅人類健康，導致大量生物質能的浪費[1-3]。餐廚垃圾滲濾液是指餐廚垃圾在壓實、發酵等生物化學降解以及降水、地下水的滲流作用下產生的一種高濃度有機廢水[4-5]。餐廚垃圾滲濾液的高效資源化利用是一個亟待解決的關鍵問題。目前，餐廚垃圾的主要處理方法包括物理化學法、填埋法和生物法等[6]，其中生物法主要包括堆肥制腐殖酸、發酵制氫、產甲烷、生產燃料乙醇及降解性塑料等[1]。

生物農藥蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)對鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和雙翅目等32個科50多種昆蟲害蟲有不同程度的致病和毒殺作用[7]，且專一性高、對人畜無害、防治效果好，占微生物殺蟲劑生產與銷售總量的95%以上[8-10]，在農業蟲害防治中發揮著重要作用。目前，沼渣、昆蟲尸體、酒糟酒曲、紅三葉鮮青草預加工廢水和餐廚垃圾[11-14]等有機廢棄物均可作為培養基原料培養Bt，但利用餐廚垃圾滲濾液作為培養基培養Bt的研究還未見報道。 作者以餐廚垃圾滲濾液為培養基，研究了Bt培養條件和去除餐廚垃圾滲濾液中主要營養成分的優化控制條件，以期為高效資源化利用餐廚垃圾滲濾液提供幫助。

1 實驗

1.1 材料與菌種

餐廚垃圾滲濾液，北京綠色空間生物科技股份有限公司；蘇云金芽孢桿菌NBIV-330，湖北康欣農用藥業有限公司。

1.2 培養基

種子培養基根據文獻[15]配制，餐廚垃圾滲濾液經濾膜過濾后，用Na2CO3調節pH值為6.6～6.8。

含不同體積分數餐廚垃圾滲濾液的液體培養基，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 餐廚垃圾滲濾液的預處理

因餐廚垃圾滲濾液原液中不溶物較多，因此需對其進行預處理：將餐廚垃圾滲濾液在10 000 r·min-1下離心5 min，取上清液過15～20 μm中速濾膜，即得澄清餐廚垃圾滲濾液。

1.3.2 Bt培養條件

100 mL三角瓶，裝液量20 mL，接種量1%(體積分數),設置3個平行樣。培養溫度35 ℃，搖床轉速200 r·min-1。實驗開始后，每天取樣在722S型分光光度計上測定光密度(OD680)。采用牛肉膏蛋白胨固體培養基，涂布平板法測定Bt菌落形成單位(CFU)。

1.3.3 分析檢測

取Bt培養物，于5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后在TOC儀(島津公司，TOC-V CPH)上測定總有機碳(TOC)和總氮(TN)濃度，采用電導率儀(EUTECH公司，CON510)測定鹽度。

2 結果與討論

2.1 餐廚垃圾滲濾液原液的理化指標

餐廚垃圾滲濾液原液中TOC和TN分別高達20.1 g·L-1和0.9 g·L-1，碳氮比為22.3，比較符合微生物生長的營養元素要求。由于餐廚垃圾滲濾液來源于食物廢棄物，所以微生物可利用的淀粉和蛋白等含量豐富[14]，為Bt的生長提供了必要且豐富的營養物質。餐廚垃圾滲濾液原液鹽度高達61‰，高鹽度培養基不利于氧的傳遞，對微生物的生長產生一定的抑制作用[16]。餐廚垃圾滲濾液原液pH值為3.4，由于Bt最適生長pH值為中性或偏堿性，因此需調節pH值接近中性。

2.2 溫度對Bt生長的影響(圖1)

圖1 溫度對Bt生長的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of Bt

從圖1a可知，Bt在35～41 ℃范圍內均可生長，但溫度越低，Bt的生長速度越快、生物量越大，35 ℃時OD680最高達到9.1，與楊航聰等[15]對蘇云金芽孢桿菌MS7的研究結果一致。孫翠霞等[17]指出Bt的最適生長溫度為(30±1) ℃。每種微生物都有最適生長溫度，同種微生物在不同的培養基中生長的最適溫度也有差別。可能是因為溫度直接影響細菌的酶反應體系，從而影響細菌對營養物質的吸收與利用，是影響Bt生長的重要因素。溫度過高導致Bt毒力效價降低，溫度過低則導致酶活性降低，代謝減緩，生長周期延長，產量降低[18]。因此后續實驗采用35 ℃培養Bt。

2.3 Bt的生長和對TOC、TN的去除(圖2)

圖2 Bt的生長和對TOC與TN的去除Fig.2 The growth of Bt and removal of TOC and TN

從圖2a可以看出，餐廚垃圾滲濾液體積分數越大，所獲得的Bt生物量越大，以100%餐廚垃圾滲濾液為培養基時，OD680最高達到8.8；以50%和25%餐廚垃圾滲濾液為培養基時，OD680最高分別為5.8和2.9。說明餐廚垃圾滲濾液所含營養物質豐富，有利于Bt的快速生長。

從圖2b可以看出，培養72 h，Bt的菌落形成單位隨餐廚垃圾滲濾液體積分數的增大而升高，最高可達4.5×107CFU·mL-1。用SPSS軟件對其進行統計學分析，結果表明：不同體積分數餐廚垃圾滲濾液的P<0.01，說明餐廚垃圾滲濾液體積分數對Bt的菌落形成單位有極顯著影響。

從圖2c、d可以看出，隨著Bt的生長，餐廚垃圾滲濾液中的TOC、TN去除效果明顯。當采用100%餐廚垃圾滲濾液為培養基時，TOC去除率最高達48.8%，TN去除率最高達52.4%；當餐廚垃圾滲濾液體積分數為50%時，TOC和TN去除率有所降低，當餐廚垃圾滲濾液體積分數降至25%時，TOC和TN去除率進一步下降。表明，餐廚垃圾滲濾液的體積分數越高，營養物質越豐富，不僅Bt的生物量越大，而且對TOC與TN的去除率也越高。從圖2c還可以看出，培養60 h后Bt進入生長衰亡期，形成芽孢且芽孢囊脫落，菌體內容物釋放，導致TOC有所上升。

2.4 外加磷源和硫源對Bt生長的影響(圖3)

在基礎培養基中額外添加1 g·L-1KH2PO4作為磷源和1 g·L-1MgSO4作為硫源后，Bt的生長量明顯升高，培養48 hOD680達到最高，為11.5(圖3a);72 h時的菌落形成單位為1.4×108CFU·mL-1，比空白對照組的Bt菌落形成單位4.8×107CFU·mL-1提高了約3倍(圖3b)。表明，在餐廚垃圾滲濾液中補充磷源和硫源對Bt的生長有明顯的促進作用。另外，經SPSS軟件對兩組的顯著性差異進行統計學分析，最終得到P<0.01，說明在餐廚垃圾滲濾液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4可以極明顯促進Bt的生長，與黃勤清等[19]發現的添加KH2PO4和MgSO4可增加Bt的菌落數以及Ozkan等[20]報道的較高濃度的無機磷可以提高Bt的殺蟲毒性相符。

圖3 外加磷源和硫源對Bt生長的影響Fig.3 Effect of additional phosphorus source and additional sulfur source on the growth of Bt

3 結論

以餐廚垃圾滲濾液為培養基，研究了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)培養條件和去除餐廚垃圾滲濾液中主要營養成分的優化控制條件。結果表明，當餐廚垃圾滲濾液體積分數在25%～100%范圍內時，隨餐廚垃圾滲濾液體積分數的增大，Bt生物量增大，Bt菌落形成單位升高，72 h達到4.5×107CFU·mL-1，對餐廚垃圾滲濾液中TOC和TN的去除效果也升高，去除率分別達到48.8%和52.4%。在餐廚垃圾滲濾液中添加1 g·L-1KH2PO4和1 g·L-1MgSO4分別作為磷源和硫源，可以促進Bt的生長，72 h菌落形成單位達到1.4×108CFU·mL-1。

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Cultivation ofBacillusthuringiensiswith Food Waste Leachate

SHEN Li-jun1,DUAN Ran-ran1,ZHANG Zhi-qiang2,XU Qian-qian1,LV Le1,LIU Xiao-lu1,YIN Chun-hua1,ZHANG Hai-yang1,YAN Hai

(1.SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China;2.BeijingGreenSpaceBiotechnologyCo.，Ltd.,Beijing100097,China)

In this paper,food waste leachate was successfully used to cultureBacillusthuringiensis(Bt) and the optimum conditions for the removal of the main nutrients in the leachate were also investigated.Results showed that,with the increasing of volume fraction of food waste leachate from 25% to 100%,the growth of Bt increased,the colony forming unit of Bt reached 4.5×107CFU·mL-1after 72 h,and the removal rates of total organic carbon(TOC) and total nitrogen(TN) increased to 48.8% and 52.4%,respectively.The colony forming unit of Bt reached 1.4×108CFU·mL-1after 72 h by adding 1 g·L-1KH2PO4as a phosphorus source and 1 g·L-1MgSO4as a sulfur source in leachate.It is demonstrated that food waste leachate can be efficiently used to culture biopesticide Bt,which is an efficient way to use waste as resource with great value of application.

Bacillusthuringiensis;food waste leachate;cultivation;treatment

2017-02-22

申麗君(1992-)，女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向：微生物學，E-mail：m18811391351@163.com；通訊作者：閆海，教授，E-mail：haiyan@ustb.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.013

X172

A

1672-5425(2017)07-0061-04

申麗君，段冉冉，張志強，等.利用餐廚垃圾滲濾液培養蘇云金芽孢桿菌[J].化學與生物工程，2017，34(7)：61-64.