殺菌劑室內空白菌量檢測方法研究

高勝華

中國石化中原油田分公司技術監測中心化工產品監測總站（河南濮陽457001）

殺菌劑室內空白菌量檢測方法研究

高勝華

中國石化中原油田分公司技術監測中心化工產品監測總站（河南濮陽457001）

在依據標準Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術要求》對殺菌劑產品質量進行檢測時，采出水空白菌量室內培養及計數是檢測的重要環節。分析了培養基加入量、培養時間及培養溫度對培養空白細菌菌量的影響，優化選擇培養基體積分數為0.20%、培養溫度為（40±5）℃、培養時間為36h，作為培養空白菌量最佳實驗條件。針對不同標準對菌量計數方法的不同要求而導致的結果偏差問題，從理論和實驗角度進行分析驗證，通過對空白菌量室內檢測及計數的方法優化，確定絕跡稀釋法為最合理計數方法，從而提高了室內殺菌效果檢測結果的準確性和時效性，對油田用殺菌劑的質量檢測工作有一定的指導意義。

殺菌劑；室內殺菌效果；細菌培養；絕跡稀釋法

油田采出水中含有大量的有機質且含氧量低，為細菌特別是厭氧菌的繁殖生長提供了有利條件，其中危害最大的是硫酸鹽還原菌（SRB）、腐生菌（TGB）、鐵細菌（FB），細菌在注水系統中大量繁殖，危害水質、造成腐蝕、堵塞油層，給油田生產造成巨大經濟損失[1-3]，這就需要在水體中加入一定量的殺菌劑進行預處理。殺菌劑通過影響細菌正常的新陳代謝而起殺菌作用，是一種能殺死或抑制各種微生物的化學產品藥劑[4-6]。因此準確及時地檢測控制殺菌劑質量至關重要。

室內殺菌效果是評價殺菌劑質量的一項重要指標，現行的行業標準和各油田企業內部標準大多采用絕跡稀釋法[7-8]來評價室內殺菌效果，中原油田采用標準Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術要求》檢測殺菌劑室內殺菌效果。標準規定，取回的水樣若因故放置超出24h，這就需要向水樣中加入營養基進行空白細菌培養，在實際檢測工作中發現：①由于選擇不同實驗條件，培養出的細菌菌量不同，造成殺菌效果檢測結果出現偏差，影響室內殺菌效果的評價；②標準規定采用2次重復法進行空白實驗，不同的檢測人員對多組測試瓶細菌計數采用的方法不同及確定成長指數的原則理解層次偏差，造成細菌計量的差異，影響室內殺菌效果的判斷[9]。因此，優化培養采出水空白菌量的室內評價及計數方法，能夠進一步提高檢測結果的準確性，減少實驗的重復性，及時準確地評價殺菌劑質量[10]。

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

DHP—9272型恒溫培養箱、電熱壓力蒸汽消毒器、細菌培養瓶（SRB）、1 mL一次性滅菌注射器、350 mL玻璃菌瓶。

1.2 實驗用水樣的要求

1）實驗用水樣取自污水站未經殺菌劑處理的水。

2）水樣應在采集后24h之內盡快進行殺菌效果實驗。如因故不能在24h內回到實驗室進行檢驗，則在水樣中加入營養基培養24～72h進行測試，營養基加入量推薦為0.1%～0.2%，污水中細菌的最佳生長溫度一般為30～50℃。

1.3 實驗步驟

1）空白實驗采用2次重復法。

2）抽取空白水樣于密閉玻璃菌瓶中，抽取的水量滿足實驗要求，放入恒溫培養箱選擇所需的培養溫度進行培養。

3）培養一定時間后，將10個細菌培養瓶排成一組并依次編號，用一次性滅菌注射器取空白水樣1.0mL注入1#培養瓶，充分震蕩，再從1#培養瓶抽取1.0mL水樣注入2#培養瓶中，依次類推，直至稀釋到第10個培養瓶為止，同理再做一組。

4）將實驗培養瓶放置于恒溫培養箱，恒溫培養7天后，觀察細菌瓶中細菌生長的情況，根據細菌生長情況和稀釋倍數，計算出水樣中細菌的數目。

2 結果與討論

2.1 水樣放置時間對菌量的影響

取回的現場采出水隨著放置時間的延長，水中的細菌量不斷變化。放置時間越長，水中環境的改變導致細菌量變化較大見表1。尤其是溫度的影響，當溫度高于水中細菌生長的適宜溫度，會導致細菌死亡；當溫度低于適宜溫度，會抑制細菌的生長甚至死亡。因此從現場取回的水樣要在30～50℃環境中放置，并盡快在24h內檢測，如果放置時間超過24h，應加入培養基在適宜的條件下進行細菌培養。

表1 水樣放置時間對SRB細菌影響數據統計表/(個·mL-1)

2.2 溫度對實驗室培養細菌的影響

取現場水配制體積分數為0.2%SRB培養基，根據污水中細菌的最佳生長溫度為30～50℃，選取30、35、40、45、50℃進行絕跡細菌培養，統計數據見表2。

表2 溫度對實驗室培養SRB細菌影響數據統計/(個·mL-1)

由表2看出：在溫度30～50℃之間進行細菌培養，隨著溫度的變化，細菌的生長菌量趨于穩定。

根據標準Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術要求》對水溫的要求，選擇（40±5）℃為培養細菌的最佳培養溫度。如現場施工對溫度有要求，則優選現場溫度進行細菌培養。

因此，在冬季取水樣過程中要對水樣瓶進行適當保溫，改進取水樣裝置，在水樣瓶的外壁裹了一層橡塑板，用以保溫，并用不透明非活性玻璃瓶代替以往的塑料桶，防止水樣中細菌吸附，減少了檢測誤差。

2.3 培養時間對細菌菌量的影響

由表2看出隨著培養時間的延長，細菌菌量不斷增大。當培養時間在36h時，產生的細菌數量滿足標準對空白的要求。同時檢測1個殺菌劑樣品需要7天時間，培養時間過長勢必會影響檢測效率，造成人力、物力的浪費，因此選擇最佳培養時間為36h。

2.4 培養基的加入量對細菌菌量的影響

在加入的培養基濃度很低情況下，培養基濃度影響細菌的生長速度，隨著培養基濃度的提高，生長速度趨于穩定；進一步提高培養基濃度，生長菌量增大，而且隨著培養基濃度過大會發生菌體菌量富集程度過高現象[11]。

將6個350 mL的玻璃菌瓶，用采出水配制體積分數為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50% SRB培養基，將實驗培養瓶放入恒溫箱中，在45℃情況下恒溫36h，用絕跡稀釋法檢測0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50%SRB細菌培養，7天后讀取細菌的生長個數（表3）。

表3 實驗室培養SRB細菌生長數據統計

由表3可以看出：當加入的培養基的體積分數為0.15%時，細菌的菌量就能滿足標準對空白菌量的要求，采出水處于隨時變化中，因此應放寬一個級別，選擇體積分數為0.20%。

2.5 選擇合理菌量計數方法

細菌培養7天后讀取細菌的生長個數，目前有兩種方法計算細菌菌量，第1種方法是標準Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術要求》中推薦的“菌量計數按SY/T 5329—2012中5.6.5條規定讀數”；第2種方法是根據SY/T 0532—2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》進行多組測試瓶細菌計數，現對兩種方法進行現場試驗分析，具體見表4～表5。

表4 1701#污水細菌生長情況（二次重復法）

表5 1707#污水細菌生長情況（二次重復法）

由表4看出，按第1種方法得出水樣中指數為“211”，查SY/T 5329—2012標準中二次重復法數據表得細菌數為13.0個/mL，再乘以指數第一位的稀釋倍數101，即得含菌量為130個/mL。按第2種方法得出水樣中指數為“110”，查SY/T 5329—2012標準中二次重復法數據表得細菌數為1.3個/mL，再乘以指數稀釋倍數102，即得水樣含菌量為130個/mL。結果：第1種方法與第2種方法計算的水樣細菌含量一致。

由表5看出，按第1種方法得出水樣中指數為“211”，查SY/T 5329—2012標準中二次重復法數據表得細菌數為13.0個/mL，再乘以指數第一位的稀釋倍數101，即得水樣含菌量為130個/mL。按第2種方法得出水樣中指數為“111”，查SY/T 5329—2012標準中二次重復法數據表得細菌數為2.0個/mL，再乘以指數稀釋倍數102，即得水樣含菌量為200個/mL。結果：第1種方法與第2種方法計算的水樣細菌含量相差70個/mL。

擴展到三次重復法計算菌數，見表6。

表6 1714#污水細菌生長情況（三次重復法）

由表6看出，按第1種方法得出水樣中指數為“320”，查SY/T 5329—2012標準中三次重復法數據表得細菌數為9.5個/mL，再乘以指數第一位的稀釋倍數101，即得水樣含菌量為95個/mL。按第2種方法得出水樣中指數為“200”，查SY/T 5329—2012標準中三次重復法數據表得細菌數為0.9個/mL，再乘以指數稀釋倍數102，即得水樣含菌量為90個/mL。結果：第1種方法與第2種方法計算的水樣細菌含量相差5個/mL。

從表5和表6可以看出，兩種計算細菌個數的方法存在不一致的情況，而生長指標所選的3級稀釋倍數，共有6個或9個細菌測試瓶。從定性分析的角度來說，將這些細菌瓶可分為兩類：一類是有細菌生長的陽性瓶，另一類是無細菌生長陰性瓶。從定量分析的角度來說，陽性瓶中有多少個細菌，不能加以量化，而陰性瓶里無細菌即0個/mL，可以加以量化，因此由陽性瓶推導的結果是不準確的，由陰性瓶推導的結果為準確結果[12]。

由表5看出：方法1中所選6個細菌測試瓶中有4個陽性瓶，2個陰性瓶；方法2所選的6個細菌測試瓶中有3個陽性瓶，3個陰性瓶。由表6看出：方法1中所選9個細菌測試瓶中有5個陽性瓶，4個陰性瓶；方法2所選的9個細菌測試瓶中有2個陽性瓶，7個陰性瓶。可見依據方法2所推導的結果比方法1更準確些，能夠更接近實際的真實情況，而方法1得出的結果誤差較大。因此細菌菌量的計算應依據SY/T 0532—2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》標準中多組測試瓶細菌計數原則進行確定。

2.6 驗證實驗

取兩批次的殺菌劑產品，用采出水進行檢測殺菌劑的技術指標室內殺菌效果。第1種方法：在24h內盡快檢測。第2種方法：將放置時間超出24h的水樣，按加入培養基的體積分數為0.20%、培養溫度為45℃、培養時間為36h，先培養空白細菌量，再進行檢測。空白細菌菌量結果的讀數依據SY/T 0532—2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》中多組測試瓶細菌計數的原則。室內殺菌效果結果的判定依據標準Q/SH 0355—2010《油田采出水處理用殺菌劑技術要求》中技術指標的要求，結果見表7。

表7 檢測SRB細菌室內殺菌效果數據

從表7得知樣品在24h內與24h后的殺菌效果基本一致，結果在誤差的范圍內，符合標準的要求。

3 結論

1）通過對培養空白細菌菌量的檢測方法影響因素分析，選擇加入培養基的體積分數為0.20%、培養溫度為（40±5）℃、培養時間為36h，作為培養空白菌量最佳實驗條件。

2）對兩種計數細菌菌量的方法進行理論與實際應用分析，得出SY/T 0532—2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》中多組測試瓶細菌計數的原則方法是最合理的細菌菌量的計數方法。

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In the quality detection of bactericide products according to the standard Q/SH 0355-2010"technical requirements for bactericide for oilfield produced water treatment",the laboratory culture and counting of the bacteria in the bactericide blank sample of oilfield produced water is important link.The effects of culture medium amount,culture time and culture temperature on the amount of bacteria in blank sample were analyzed,and the optimum bacterium culture conditions were determined：the volume fraction of culture medium is 0.2%,the culture temperature is(40+5)℃,and the culture time is 36 h.It is theoretically analyzed and experimentally verified that different requirements of different standards to bacterial count method lead to the difference in the bacterial count results.Through the optimization of the laboratory bacterium detection and counting methods,it is held that extinction dilution method is the most reasonable bacterium counting method,which improves the accuracy and timeliness of the laboratory sterilization effect detection results of bactericides.The research result in this paper has certain guiding significance of quality inspection of bactericides.

bactericide;laboratory bactericidal effect;bacterial culture;extinction dilution method

左學敏

2017-02-09

高勝華（1970-），女，工程師，主要從事油田化學劑的質量監督檢驗與研究工作。