rhEPO通過調節JAK2/STAT5信號通路減少大鼠腦出血后神經細胞凋亡

梁俊君　王亞冰　辛海濱

[摘要]目的 探討重組人促紅細胞生成素rhEPO是否通過JAK2/STAT5信號通路減少腦出血后神經細胞的凋亡。方法 將8周齡的Wistar雄性大鼠30只隨機分3組：假手術組、ICH模型組、rhEPO組，每組10只。ICH模型組大鼠進行ICH造模，假手術組除不注血外，其余步驟同ICH模型組，rhEPO組術后5 min給予腹腔注射rhEPO，所有動物24 h后進行神經功能學評分，收集大鼠腦組織，利用原位缺口末端標記法檢測神經細胞凋亡的變化；采用免疫組織化學SP法檢測凋亡蛋白Caspase3表達；并采用Real-time PCR和Western blot檢測磷酸化JAK2、磷酸化STAT5基因和蛋白表達情況。結果 手術建立腦出血模型后24 h進行神經功能評分。按 Longa5分制標準判定，ICH 組4只評價為1分，3只評價為2分，2只評價為3分；rhEPO組治療后，5只評價為1分，2只評價為2分，1只評價為3分，說明rhEPO可以改善大鼠腦出血后神經元損傷，恢復神經功能。與假手術組相比，ICH模型組和rhEPO組中神經元凋亡細胞及Caspase3的蛋白表達陽性細胞數明顯增多（P<0.05），而rhEPO組中凋亡細胞與ICH模型組相比明顯減少（P<0.05）；與假手術組相比，ICH模型組和rhEPO組中JAK2和STAT5的蛋白表達和mRNA表達顯著上升（P<0.05），與ICH模型組相比，rhEPO組中JAK2和STAT5的蛋白表達和mRNA表達顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 外源性rhEPO可以通過調節JAK2/STAT5信號改善大鼠腦出血后神經元損傷，對于神經系統具有保護作用。

[關鍵詞]rhEPO；腦出血；神經保護；JAK2/STAT5 信號通路

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（a）-0008-05

[Abstract]Objective To investigate whether recombinant human erythropoietin （rhEPO） could decrease neuron apoptosis after cerebral hemorrhage by regulating JAK2/STAT5 signaling pathway.Methods 30 Wistar male rats of 8 weeks old were randomly divided into 3 groups：sham operation group，ICH model group and rhEPO group，the rats in ICH model group were treated with ICH.In the sham operation group，the treatment were same as ICH group except blood injection.rhEPO group was injected with rhEPO at 5 min after operation.All animals were scored with neurological score at 24 h after the ICH model was established.The effect of neuronal apoptosis were detected by TUNEL staining.The expression of pro-apoptosis protein Caspase3 was detected by immunohistochemistry.The expressions of JAK2 and STAT5 mRNA and protein were measured by Real time PCR and Western blot.Results Neurological score was performed 24 hours after the establishment of the intracerebral hemorrhage model.According to the criteria of Longa5 standard，in ICH group，four rats were evaluated as score 1，three rats were rated as score 2 and two rats were rated as score 3.In rhEPO group，five rats were evaluated as score 1 and two rats were rated as score 2，one rat were rated at score 3，indicating that rhEPO can ameliorate neuronal damage and restore nerve function after intracerebral hemorrhage in rats.Compared to sham group，the quantity of apoptotic cells and the expression of Caspase3 in ICH model group and rhEPO group were significantly increased （P<0.05），while the apoptotic cells in rhEPO group were significantly down-regulation compared with the ICH group （P<0.05）.Compared with the sham group，the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in ICH group and rhEPO group were significantly up-regulated （P<0.05），while the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in rhEPO group were decreased significantly compared to ICH group （P<0.05）.Conclusion rhEPO reduce neuronal apoptosis by regulating JAK2/STAT5 signal after cerebral hemorrhage，and has protective effect on the nervous system in rats .

[Key words]rhEPO；Intracerebral hemorrhage；Neuroprotection；JAK2/STAT5 signal pathway

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中中的第二大類疾病，腦卒中患者中15%的患者是腦出血疾病[1]。腦出血特點是進展較快、高致殘率和高死亡率[2]。據報道，腦出血病號的死亡率高達40%，腦出血后細胞的死亡會造成腦出血后對腦的二次損傷[1]。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是調節血細胞生成的一種細胞因子，之前的研究報道表明EPO對腦以及身體其他器官有保護作用。EPO對實驗性的腦梗死、缺血再灌注損傷均有保護作用[3-4]。EPO可以通過磷酸化激活AKT信號通路提高腦損傷后神經細胞的生存率[5]，但對于EPO是否可以保護腦出血后神經細胞以及相應的機制研究較少。本實驗旨在探討外源性rhEPO對于神經系統的保護作用，采用大鼠腦出血ICH模型，觀察重組人紅細胞生成素（rhEPO）對大鼠腦ICH模型治療后，對神經細胞凋亡以及凋亡相關蛋白Caspase3表達的影響，并探討相關作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

重組人促紅細胞生成素購自上海索寶生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀-7500購自美國Thermo Fisher公司；電泳設備購自Major Science；多克隆Caspase3、JAK2、STAT5一抗購自美國abcam試劑公司；堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG二抗購自上海安馳生物科技有限公司； DAB顯色試劑盒和TUNEL凋亡試驗盒購自上海索寶生物科技有限公司；蛋白濃度測定使用BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2實驗動物與分組處理

8周齡SPF級雄性Wistar大鼠30只（購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司）。大鼠飼養在SPF級動物實驗室，溫度為（22±2）℃， 12 h/12 h晝夜循環光照。大鼠構建腦出血ICH模型后隨機分為3組：假手術組、ICH模型組和rhEPO組，每組10只。

1.3方法

1.3.1 ICH模型的制備 腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠，將大鼠固定于腦立體定位儀上，消毒切開頭皮，微量注射儀取大鼠自體不凝血50 μl，而后勻速緩慢2～3 min注入右側大鼠尾狀核部位，留針10 min再緩慢拔出，縫合切口。治療組術后腹腔注射rhEPO（3000 IU/kg），假手術組步驟同上，僅不注射血。假手術組與ICH模型組術后腹腔注射0.5 ml生理鹽水。

1.3.2腦標本采集與組織切片制備 大鼠用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，依次用4℃生理鹽水400 ml，4%多聚甲醛400 ml進行心臟灌注。取腦后用4%多聚甲醛固定48 h后，常規脫水、透明及浸蠟包埋，制備厚度為5 μm的石蠟切片，分別用于免疫組織化學染色及TUNEL凋亡檢測。

1.3.3神經功能評分 手術后功能缺損按 Longa5分制標準進行評分。0分：無明顯神經病學癥狀；1分：不能完全伸展左前肢；2分：向左側旋轉；3分：行走時向左側傾倒；4分：不能自行行走， 有意識障礙。ICH造模后24 h檢測動物的神經功能評分。

1.3.4 TUNEL原位凋亡細胞檢測 3%濃度 H2O2室溫孵育石蠟切片10 min，37℃下用蛋白酶K消化10 min。37℃加入標記液孵育2 h，室溫加封閉液孵育30 min。加入生物素化抗地高辛抗體室溫孵育30 min，SABC試劑加入其中恒溫37℃反應30 min，DAB顯色液加入其中進行顯色，用顯微鏡進行觀察。凋亡陽性細胞為細胞核含有棕黃色顆粒者，每張切片計數5個視野，計算切片凋亡細胞數。

1.3.5 免疫組織化學法檢測Caspase3表達 PBS洗滌切片3次，室溫下滴入血清進行封閉30 min，而后濾紙吸取殘留的血清，加入一抗Caspase3（1∶500）孵育過夜，隔夜復溫45 min，PBS洗滌3次，二抗（1∶1000）孵育30 min，PBS洗滌三次，加入SP室溫反應30 min，加入DAB顯色液。顯微鏡觀察。細胞核中含有棕黃色顆粒為陽性，取5個視野，計算切片中的表達Caspase3的陽性細胞數目。

1.3.6 Western blot檢測磷酸化JAK2、STAT5的表達量 按照100∶1的比例混合裂解液與PMSF，裂解液裂解大腦組織后，低溫離心10 min，轉速為12 000 r/min，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，調整各組的蛋白總量為30 μg/μl。取各組樣品加入電泳槽中進行電泳，基層膠20 min、80V，分離膠60 min、120 V，按蛋白分子量大小切膠，轉膜，用BSA封閉PVDF膜1 h，加入一抗（1∶500），4℃孵育過夜，隔夜室溫下用TBST洗膜3次，加入二抗（1∶1000），孵育1 h，用TBST洗膜3次，加入顯色液進行顯色3 min，用Quantity-one軟件以及Bio-Pro凝膠成像分析儀成像對各條帶進行灰度掃描從而得出相應蛋白表達量。

1.3.7 Real-Time PCR檢測大鼠JAK2、STAT5 mRNA表達含量 用Trizol提取中腦組織RNA，用Prime ScriptRRT試劑盒逆轉錄合成cDNA （購自TaKaRa公司），用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行Real-time PCR操作（購自TaKaRa），其引物序列為：JAK2——F：5′-GCTCCTCTCCTTGACGACTTT-3′，R：5′-ACCTTATCCGCTTCCGAGTTA-3′；STAT5——F：5′-GGGC-ATCACCATTGCTTGGAAG-3′，R：5′-GGAGCTTCTGGCAGAAGTGAAG-3′；Β-ACTIN——F：5′-TGGGT-CAGAAGGACTCCTATG-3′，R：5′-CAGGCAGCTCATA-GCTCTTCT-3′。

PCR反應獲得閾值循環數（cycle threshold，CT），而后采取CT值比較法，即利用起始cDNA濃度的對數與CT值成反比關系，從而計算出不同樣本之間的相對百分數。公式為 ΔΔCT=（CT.實驗組目的基因-CT.實驗組管家基因）-（CT.對照組目的基因-CT.對照組管家基因）。目的基因的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.4統計學處理

數據使用統計分析軟件SPSS 13.0進行處理，計量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以 P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組的神經功能評分

如表1所示，手術建立腦出血模型后24 h進行神經功能評分。按 Longa5分制標準判定，ICH 模型組4只評價為1分，3只評價為2分，2只評價為3分；rhEPO組治療后，5只評價為1分，2只評價為2分，1只評價為3分，說明rhEPO可以改善大鼠腦出血后神經元損傷，恢復神經功能。

2.2 TUNEL凋亡檢測結果

如圖1所示，假手術組僅僅見到極少量凋亡細胞，ICH模型組和rhEPO組凋亡細胞明顯增多。圖2表示TUNEL原位凋亡細胞檢測凋亡細胞數的變化，與假手術組相比，ICH模型組和rhEPO組中凋亡細胞明顯增多（P<0.05）；與ICH模型組相比，rhEPO組中凋亡細胞明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 Caspase3免疫組織化學結果

由圖3可知，假手術組、ICH模型組和rhEPO組的Caspase3蛋白的染色強度差異有統計學意義（P<0.05）。如圖4，免疫組織化學的光密度結果分析顯示，ICH模型組和rhEPO組中的Caspase3蛋白表達含量均比假手術組中的蛋白表達有顯著增加（P<0.05）。與ICH模型組中的Caspase3蛋白表達含量相比，rhEPO組中的Caspase3表達含量顯著降低（P<0.05）。

2.4 JAK2、STAT5蛋白表達水平

如圖5，與假手術組相比，ICH模型組和rhEPO組中JAK2、STAT5的蛋白表達量顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）；與ICH模型組相比，rhEPO組中的JAK2、STAT5蛋白表達量顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），說明rhEPO組可以調節JAK2/STAT5信號通路的蛋白水平改善大鼠腦出血后神經元損傷。

2.5 JAK2、STAT5 mRNA表達水平

如圖6，與假手術組相比，ICH模型組和rhEPO組中JAK2、STAT5的mRNA表達量顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）；與ICH模型組相比，rhEPO組中的JAK2、STAT5 mRNA表達量顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），說明rhEPO組可以調節JAK2/STAT5信號通路的基因水平來緩解大鼠腦出血后神經元損傷。

3 討論

隨著人群年齡的增長，腦出血的發生率顯著升高，致殘致死率高[6]。腦出血后原發性的腦損傷主要是由于腦血腫對于鄰近腦組織的損傷，腦出血后繼發性的損傷也是腦出血后病人神經功能的損傷的重要原因[7]。繼發性的腦損傷原因包括細胞死亡、腦水腫、血腦屏障的破壞，相關機制包括炎癥反應、細胞毒性、細胞凋亡后釋放的物質、酶活性的抑制等[8]。腦出血后各種酶的變化也會導致細胞的凋亡[7，9-10]，因此，抑制細胞凋亡、保護神經細胞是治療腦血管病的重要基礎。EPO是一種存在于人體內的一種糖蛋白，具有提高造血的功能。最近研究表明，EPO可以促進神經系統再生以及抑制細胞凋亡、提高細胞生存率[11]。之前有報道稱，EPO可以通過磷酸化激活AKT促進神經細胞的存活。有研究表明，EPO及促紅細胞生成素受體在腦組織中均有表達[12]，并且rhEPO預處理對體外培養的神經細胞有明顯的保護作用，EPO具有保護神經細胞的作用[13-14]。作為一個最新的保護因子，其保護作用及其機制引起大量的研究。但是EPO在腦出血中的作用及其相關機制研究較少[15]。

腦出血之后血腫周圍的細胞會出現凋亡[16]。其中信號通路是多種細胞因子和生長因子等的共同通路[17]，應激反應時，JAK2/STAT5 的信號傳導可以與胞膜上的 JAK 結合位點，并促使 STAT磷酸化，完成與目的基因的信號傳導和表達調控[18]。JAK-STAT在細胞的凋亡、分化、增殖以及各種中樞神經系統疾病中具有重要作用[19-20]。

本研究結果顯示，凋亡細胞數和Caspase3的蛋白表達陽性細胞數在ICH模型組和rhEPO組中顯著增多，說明在ICH模型組和rhEPO組中，腦出血模型建立成功，并且神經元損傷較多，細胞凋亡發生明顯。但與ICH模型組相比，rhEPO組中凋亡細胞和Caspase3的蛋白表達陽性細胞數明顯減少，說明rhEPO具有神經保護作用，可以產生抗細胞凋亡的作用。ICH模型組和rhEPO組中JAK2、STAT5的蛋白和mRNA表達量顯著增高，說明腦出血過程中JAK2/STAT5信號通路參與了神經損傷過程；而與ICH模型組相比，rhEPO組中的JAK2、STAT5蛋白和mRNA表達量顯著下降，說明rhEPO組可以調節JAK2/STAT5信號通路的蛋白和mRNA水平改善大鼠腦出血后神經元損傷。本實驗結果說明JAK2、STAT5的顯著性表達參與了腦出血ICH發生的重要階段，可以通過促進細胞凋亡過程導致神經細胞損傷。而rhEPO可以通過調節JAK2/STAT5信號通路來緩解神經細胞損傷，在神經細胞保護抗凋亡過程中起重要作用。

綜上所述，rhEPO的神經保護作用機制可能是JAK2/STAT5信號機制通路所介導的抗凋亡的作用。研究rhEPO在腦出血發生后產生保護作用的具體機制，對減少腦出血后減少細胞凋亡，保護神經細胞，促進神經功能的恢復有著重要意義，可以為臨床治療提供有效的幫助。

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（收稿日期：2017-03-17 本文編輯：許俊琴）