富氫液通過PI3K通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

陳克研，董婉維

(中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110001)

富氫液通過PI3K通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

陳克研，董婉維

(中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110001)

目的 探討富氫液對大鼠腦缺血再灌注致海馬神經元凋亡及PI3K/Akt/FoxO1信號通路表達的影響。方法 采用線栓法阻塞大鼠大腦中動脈，建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)模型，SD 大鼠隨機分為假手術組(Sham 組)、缺血/再灌注組(I/R組)和富氫液處理組(HRS組)，每組 10只；各組于再灌注后24 h，ELISA檢測血清中炎癥因子IL-6、TNF-α及IL-1β的變化；HE染色觀察海馬變化，TUNEL 法觀察腦組織細胞凋亡情況；Western blot法檢測海馬p-PI3K、Akt、caspase-3和FoxO1蛋白表達變化。結果 與Sham組相比，I/R組錐體細胞排列疏松，大量錐體細胞死亡，海馬凋亡細胞增多，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、表達顯著增加(P< 0.05)，腦組織中p-PI3K、Akt、caspase-3表達顯著升高，FoxO1蛋白降低，兩組間比較均具有統計學差異(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組炎癥因子顯著降低；p-PI3K、Akt、caspase-3表達水平均顯著降低，，FoxO1蛋白升高(P< 0.05)。結論 富氫液可以減輕缺血再灌注導致的腦損傷，其機制可能與PI3K/Akt/FoxO1信號通路相關。

富氫液；缺血再灌注；PI3K；FoxO1；細胞凋亡

對缺血腦組織進行及時再灌注是治療腦卒中的有效措施之一，在腦缺血再灌注時，缺血局部組織會釋放大量炎癥因子，這些激活的炎癥細胞會浸潤到局部組織，并激活相關的炎癥信號通路，進而導致腦組織發生更嚴重的炎癥性損傷[1-3]。此外，有研究發現，缺血再灌注損傷會伴隨著細胞凋亡的發生，且細胞凋亡會隨著缺血時間的延長而加重，凋亡在缺血/再灌注損傷的病理過程中的作用不容忽視[4]。目前認為，缺血再灌注損傷導致的炎癥反應和凋亡與磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)及其下游蛋白AKT信號通路的激活息息相關[5]。氫氣通過特殊加壓方式溶到生理鹽水而獲得的富氫液(hydrogen rich saline，HRS)是很好的抗氧化物，集高氫量、弱堿性、負電位、小分子水為一體，平衡身體酸堿度，可有效防止多種疾病[6，7]。已有報道顯示HRS在肝臟、腸缺血再灌注中對相應臟器有保護作用，而有關HRS在腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)中是否具有器官保護作用、其機制是否與抗炎性反應有關尚缺少相關研究。本研究通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，采用富氫液進行預處理，探討富氫液對缺血再灌注大鼠腦損傷和PI3K通路蛋白表達的影響，闡明富氫液對腦組織損傷的保護作用及分子機制，旨在為富氫液治療大腦缺血/再灌注損傷提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠40只，250 ～ 300 g，源于中國醫科大學實驗動物部【SCXK(遼)2013-0001，SYXK(遼)2013-0007)】。實驗隨機分為假手術組(sham組)，缺血/再灌注組(I/R組)，富氫液處理組(HRS組)。H組大鼠于再灌注開始靜脈泵注富氫水5 mL/(kg·h)至灌注結束；模型組動物注射等量的生理鹽水；假手術組組動物在麻醉后僅動脈分離手術。

1.2 富氫水的制備

參照文獻[8]制備富氫水溶液，將醫用注射液軟包裝袋，用低壓艙0.8個大氣壓減壓處理24 h，常壓下置12 h，將飽和部分的氣體析出；將包裝袋置于4℃冰箱冷卻；取預冷的生理鹽水，取總體積的15%，注入同體積的純氫氣；將注入氫氣后的鹽水放入加壓艙，4℃下持續加壓24 h，使氫氣充分溶入注射液，取出后置4℃保存。

1.3 腦缺血/再灌注動物模型的制備

腦缺血/再灌注動物模型的制備參照文獻進行[9]。大鼠經腹腔注射 2% 戊巴比妥鈉進行麻醉，結扎右側翼腭動脈和頸外動脈。在大鼠頸外動脈距結扎處約0.5 cm處用注射器針頭刺一小口，將尼龍線栓經右側頸外動脈主干切口緩慢向頸內動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進 18 ～ 20 mm 感到輕微阻力時，即已阻斷大腦中動脈。阻斷 2 h 后，拔出尼龍線并扎緊動脈殘端，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血/再灌注損傷模型。

1.4 標本采集

各組于缺血再灌注術后24 h處死實驗動物，經頸內靜脈采血3 mL離心法分離血漿，采用ELISA試劑盒(美國 USCN)檢測血漿中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β；另取右側海馬組織，置于福爾馬林液中，常規石蠟包埋，HE染色觀察組織學變化，TUNEL染色觀察神經細胞凋亡情況；另一部分置液氮中，Western blot技術檢測p-PI3K、Akt、caspase-3和FoxO1蛋白表達變化。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 富氫液對缺血再灌注大鼠海馬形態學改變的影響

Sham組大鼠海馬區域神經細胞形態正常，排列規則、胞質均染，細胞核呈圓形或卵圓形，未見明顯病變；I/R組大鼠海馬區域細胞排列紊亂，核固縮、溶解，神經元細胞及錐體細胞死亡，細胞數量明顯減少；HRS組大鼠可見海馬區域細胞紊亂程度減輕，變性/壞死的神經細胞明顯減少(圖1)。

2.2 富氫液對血漿中炎癥因子表達的影響

與sham組相比，I/R組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、和TNF-α的表達顯著升高，差異有顯著性(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α的表達顯著降低，差異有顯著性(P< 0.05)(表1)。

2.3 富氫液對大鼠海馬神經元凋亡的影響

TUNEL陽性細胞呈棕黃色，細胞核著色。與sham組比較，I/R組TUNEL陽性細胞數量顯著增加，差異有顯著性(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組腦組織海馬區域TUNEL陽性細胞數量顯著降低(P< 0.05)(圖2)。

2.4 富氫液對大鼠凋亡蛋白p-PI3K、Akt、caspase-3和FoxO1蛋白表達的影響

與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中p-PI3K、Akt、caspase-3表達顯著升高，FoxO1蛋白降低，兩組間比較均具有統計學差異(P< 0.05)；與I/R組相比，HRS組大鼠腦組織p-PI3K、Akt、caspase-3表達顯著降低，FoxO1蛋白升高，差異有顯著性(P< 0.05)(圖3)。

圖1 大鼠海馬的組織學改變(HE染色)Fig.1 Histological changes of hypocampal neurons in the rats (HE staining)

指標/分組Index/Group假手術組Shamgroup缺血/再灌注組I/Rgroup富氫液處理組HRSgroupS100?β/ng/L3687±0．9111296±1．45a6842±1．30abTNF?α/μg/L7554±10．2119651±30．31a11847±10．14abIL?6/ng/L2097±2．386869±3．39a4536±5．14ab

注：與Sham組相比，aP< 0.05；與HRS組相比，bP< 0.05。

Note. Compared with the sham group,aP<0.05; Compared with the HRS group,bP<0.05.

圖2 海馬神經元的凋亡狀況(TUNEL染色)Fig.2 Apoptosis in the hypocampal neurons in the rats (TUNEL staining)

圖3 Western blot檢測大鼠海馬組織中 多種基因蛋白表達的比較Fig.3 Changes of expressions of p-PI3K, Akt, caspase-3, FoxO1, and GAPDH in the rats detected by Western blot assay

3 討論

本研究通過建立大鼠局灶性缺血再灌注腦損傷模型，采用HE染色、TUNEL、ELISA和Western blot等技術，觀察富氫液對大鼠海馬區神經元形態學改變、細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3、炎癥因子和PI3K/Akt/FoxO1通路蛋白表達的影響。結果發現，富氫液可以減少缺血再灌注導致的大腦海馬區形態學改變，降低炎癥因子表達、減少細胞凋亡產生。此外，研究發現，富氫液可以降低缺血再灌注導致的PI3K、Akt和FoxO1通路蛋白表達，結果提示富氫液可以減輕缺血再灌注導致的大鼠腦損傷，其機制可能是通過調控PI3K/Akt/FoxO1通路來實現。

氫氣本身就是一種最佳天然抗氧化劑，所以加入氫氣的水具有很強的還原功能，可以中和身體血液和細胞里的自由基。將氫氣溶于生理鹽水制備富氫液很容易進入細胞通道，參與新陳代謝，從而促進細胞排毒，增加了細胞的水合作用，提升人體的免疫力[10，11]。通過動物實驗或臨床實驗均證實，人或動物引用HRS后，對心、肝臟、肺臟和腸等缺血再灌注引發的相應器官損傷有明顯的抑制作用，可以減輕機體炎癥反應和過度氧化，對臟器有保護作用[12，13]。研究發現，富氫液對脂多糖(LPS)誘導的大鼠急性肺損傷進行干預，它可以有效減少肺和支氣管肺泡灌洗液的蛋白濃度、降低肺濕/干重比，顯著抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1α、VCAM-1 mRNA表達，結果表明，富氫液在臨床上可用于有效治療急性肺損傷的抗炎劑[14]。Huang等[15]研究發現富氫液可以降低潰瘍性結腸炎大鼠血清LDH、ALP、IL-1β、TNF-α和MPO 水平，而增加前列腺素E2和IL-10水平，結果提示富氫液可用于治療潰瘍性結腸炎，為富氫液的臨床抗炎應用提供了直接證據。本研究發現，富氫液顯著降低缺血再灌注大鼠腦組織促炎因子IL-1β、IL-6、和TNF-α的表達。此外，富氫液還可以顯著降低缺血再灌注導致促凋亡蛋白caspase-3表達，提示富氫液對缺血再灌注大鼠腦損傷有保護作用，這種作用是通過抗炎和抗凋亡實現的。

既往的研究證實PI3K/AKT信號通路參與了腦缺血神經細胞凋亡，內在通路和外部的炎癥激活時均可驅動AKT介導的細胞存活通路，激活磷脂酰肌醇3激酶連接AMPA受體的胞內C末端，可激活其下游激酶Akt ser473殘基磷酸化，誘導下游蛋白FoxO1向細胞膜轉位，磷酸化Ser9導致FoxO1失活，磷酸化β連環蛋白促進細胞生存。同時抑制下游蛋白caspase-3激活，從而抑制促炎因子釋放，發揮抗炎、抗凋亡、減少腦損傷作用[16-18]。本研究發現，與對照組相比，缺血再灌注大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 和p-FoxO1蛋白表達均顯著增加，而經過富氫液預處理后大鼠腦組織p-PI3K、p-Akt 和p-FoxO1表達顯著降低，結果提示，富氫液可能通過激活PI3K/Akt/FoxO1通路，對缺血再灌注大鼠腦損傷發揮保護作用。

綜上，富氫液可以減少缺血再灌注導致的大腦海馬區形態學改變，降低炎癥因子表達、減少細胞凋亡產生，其機制可能是通過調控PI3K/Akt/FoxO1通路來實現。

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Hydrogen-rich saline reduces cerebral ischemia-reperfusion injury in ratsvia PI3K pathway

CHEN Ke-yan， DONG Wan-wei

(Department of Laboratory Animal Science, China Medical University, Shenyang 110001, China)

Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline on apoptosis in hippocampal neurons induced by cerebral ischemia-reperfusion in rats and PI3K/Akt/FoxO1 signaling pathway. Methods The rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by thread-occlusion of the middle cerebral artery in rats. SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham group), ischemia-reperfusion group (I/R group) and hydrogen-rich saline treatment group (HRS group), 10 rats in each group. At 24 h after reperfusion, the serum levels of IL-6, TNF-a and IL-1β were detected by ELISA. Histological changes of the hippocampus were observed by pathology using HE staining. Apoptosis in brain tissues was observed by TUNEL staining. The expression changes of p-PI3K, Akt, caspase-3 and FoxO1 proteins were detected by Western blot assay. Results Compared with the sham group, pyramidal cells were arranged loosely in the I/R group and a large number of pyramidal cells were necrotized, and the amount of apoptotic hippocampal cells was increased. The levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly increased (P< 0.05), as well as the expression of p-PI3K, Akt and caspase-3 in the brain tissue. However, the expression of FoxO1 protein was decreased. There were significant differences between the two groups (P< 0.05). Compared with the I/R group, the inflammatory factors were significantly decreased in the HRS group. The expressions of p-PI3K, Akt and caspase-3 were also significantly decreased, while the expression of FoxO1 protein was increased (P< 0.05). Conclusions Hydrogen-rich saline can reduce brain injury caused by ischemia-reperfusion, and its mechanism may be related to PI3K/Akt/FoxO1 signaling pathway.

Hydrogen rich saline; Ischemia reperfusion; PI3k; FoxO1; Apoptosis

國家自然青年科學基金項目(31201758)；中國醫科大學新教師基金項目(XZR20160036)。

陳克研(1983-)，男，博士，講師，從事基礎醫學和實驗動物研究。 E-mail: chenkeyan888@163.com

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0013-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.003

2017-01-05