兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中環(huán)磷酰胺給藥方式的探討

孔菲菲，張 彤，龔夏實，張 航

(湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司/湖北省藥物安全性評價中心，武漢 430061)

兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中環(huán)磷酰胺給藥方式的探討

孔菲菲，張 彤，龔夏實，張 航

(湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司/湖北省藥物安全性評價中心，武漢 430061)

目的 探討環(huán)磷酰胺不同給藥途徑、給藥劑量對妊娠家兔胚胎及胎仔的影響，以確定誘導(dǎo)胎兔畸形最佳的給藥方式。方法 孕兔分為生理鹽水對照C組、靜脈注射Y1組(15 mg/kg)、皮下注射低劑量Y2組(20 mg/kg)和皮下注射高劑量Y3組(30 mg/kg)，各組均在GD10 ～ 13(受孕當(dāng)天為GD0)分別按相應(yīng)途徑給藥。GD28解剖，檢查黃體數(shù)、著床數(shù)、連胎子宮重、吸收胎率；取胎仔，檢查胎仔性別、身長、尾長、活胎數(shù)、死胎數(shù)，并按要求進行外觀畸形、內(nèi)臟畸形和骨骼畸形的檢查。結(jié)果 環(huán)磷酰胺靜脈注射組及皮下注射低劑量組孕兔胎仔均出現(xiàn)了畸形，兩組外觀畸形率分別為30.77%和95.65%，骨骼畸形率分別為7.69%和73.91%，內(nèi)臟畸形率分別為20.51%和47.83%。皮下注射高劑量組吸收胎發(fā)生率為100%。結(jié)論 孕兔在GD10 ～ 13皮下注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg可用作家兔胚胎-胎仔毒性發(fā)育試驗的陽性給藥方法。該方法給藥周期短，操作方便，吸收胎少，胎仔畸形率高，可為同行選擇合適的兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性陽性模型提供依據(jù)。

胚胎-胎仔發(fā)育；胚胎畸形；環(huán)磷酰胺；兔

生殖毒性研究是藥物非臨床研究的重要內(nèi)容，是藥物進入臨床研究及上市的重要環(huán)節(jié)。生殖Ⅱ段，即胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗，研究胚胎從著床到硬腭閉合期間給藥，受試藥物是否具有胚胎毒性或致畸性。胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗需選用兩種哺乳動物，一般非嚙齒類選擇家兔[1]。國內(nèi)外關(guān)于家兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中陽性藥物選擇的文獻較少，國內(nèi)已有研究表明[2]，環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)家兔胎仔產(chǎn)生畸形，但其最佳給藥途徑和給藥劑量還有待于進一步研究。本研究擬以環(huán)磷酰胺為受試藥，研究不同給藥途徑和給藥劑量下，家兔胚胎及胎仔的發(fā)育狀況，確定最佳的給藥方式。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑

注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn))，75%乙醇(武漢市一輕江南公司竹葉酒精分裝部生產(chǎn))，氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))，苦味酸(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))，茜素紅(上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站經(jīng)銷)，甲醛溶液(廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn))，氫氧化鉀(國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，冰醋酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，丙三醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 實驗動物

日本大耳兔，普通級，體重2.5 ～ 3.5 kg，購自武漢生物制品研究所【SCXK(鄂)2012-0003】。兔受孕后運回，飼養(yǎng)在湖北省藥物安全性評價中心【SYXK(鄂)2014-0023】，飼養(yǎng)溫度16 ～ 26℃，相對濕度為35% ～ 85%，光照為12 h明暗交替。1.1.3 主要儀器

奧豪斯CAV2101天平(美國奧豪斯儀器有限公司制造)，Nikon SMZ-800體視顯微鏡(日本尼康公司制造)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥[2，3]

35只孕兔經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后選取32只采用計算機隨機分為4組，每組8只，即生理鹽水對照組(C組)：GD10 ～ 13耳緣靜脈注射生理鹽水，3 mL/kg；靜脈注射組(Y1組)：GD10 ～ 13耳緣靜脈注射環(huán)磷酰胺，15 mg/kg；皮下注射低劑量組(Y2組)：GD10 ～ 13皮下注射環(huán)磷酰胺，20 mg/kg；皮下注射高劑量組(Y3組)：GD10～13皮下注射環(huán)磷酰胺，30 mg/kg。

1.2.2 觀察指標(biāo)[4，5]

(1)一般情況觀察

試驗期間檢查孕兔體征和活動情況，并作詳細記錄，若動物有死亡，對死亡孕兔應(yīng)稱重并進行尸檢。

(2)體重

孕兔于運回當(dāng)日稱重，并記錄GD6、GD10、GD11、GD12、GD13、GD15、GD18及GD21、GD24、GD28體重。

(3)攝食量測定

每周測一次攝食量，計算孕兔的攝食量。

1.2.3 剖檢

GD28空氣栓處死孕兔，取出子宮，稱連胎子宮重后剖宮取出胎兔。記錄黃體數(shù)、植入數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)。胎兔逐一檢查外觀、性別、體重，并測量身長和尾長。所有胎兔將雙腎、心臟放入Bouin氏液固定后檢查，其他內(nèi)臟于解剖當(dāng)日進行新鮮檢查。檢查完成后將偶數(shù)號胎仔頭部從頸部切下，放入Bouin氏液固定，后期徒手切片觀察；奇數(shù)號胎仔連同去掉頭部的偶數(shù)號胎仔一起放入75%乙醇中，制成骨骼透明標(biāo)本進行骨骼檢查。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 環(huán)磷酰胺對孕兔一般狀況的影響

給藥期間各組孕兔生長狀況良好，孕兔毛被光澤，活動正常，大小便也未出現(xiàn)異常，各組孕兔均存活到GD28，均未觀察到流產(chǎn)、早產(chǎn)等癥狀。GD12，皮下注射高劑量組孕兔攝食量較對照組顯著降低(P< 0.05)，可見給予高劑量的環(huán)磷酰胺后，對母體產(chǎn)生了一定的毒性。給藥結(jié)束后，各給藥組孕兔攝食量與對照組差異無顯著性(P> 0.05)。在整個給藥和觀察期間，孕兔的體重和對照組相比差異無顯著性(P> 0.05)，體重和攝食量變化見表1、表2。

表1 環(huán)磷酰胺對孕兔體重的影響Tab.1 Effect of cyclophosphamide on body weight of the pregnant rabbits

注：與生理鹽水對照組比差異有顯著性*P< 0.05，差異有顯著性**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, compared with the saline control group.

表2 環(huán)磷酰胺對孕兔攝食量的影響Tab.2 Effect of cyclophosphamide on food intake of the pregnant rabbits

注：與生理鹽水對照組比差異有顯著性*P< 0.05，差異有顯著性**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, compared with the saline control group.

表3 環(huán)磷酰胺對兔妊娠結(jié)局的影響Tab.3 Effects of cyclophosphamide on pregnancy outcome in the rabbits

注：與生理鹽水對照組比差異有顯著性*P< 0.05，差異有顯著性**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, compared with the saline control group.

2.2 環(huán)磷酰胺對兔妊娠結(jié)局的影響[6]

GD28解剖各組孕兔，大體解剖均未見母體有異常。由于皮下注射高劑量組100%為吸收胎，故與對照組相比，環(huán)磷酰胺皮下注射高劑量組連胎子宮重、活胎數(shù)(率)、吸收胎數(shù)(率)均有極顯著性差異。環(huán)磷酰胺靜脈注射組、皮下注射低劑量組與對照組相比，孕兔妊娠結(jié)局均沒有顯著影響(P> 0.05)，見表3。

2.3 環(huán)磷酰胺對胎仔體重、身長、尾長的影響

GD28解剖孕兔后，取出胎兔，測量胎兔體重、身長、尾長(見表4)。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺靜脈注射組體重、身長，皮下注射低劑量組胎兔的體重、身長、尾長與對照組相比均差異有顯著性(P< 0.01)。

2.4 環(huán)磷酰胺對兔胎仔外觀、骨骼、內(nèi)臟的影響

家兔解剖后觀察胎仔外觀畸形，胎仔骨骼及內(nèi)臟經(jīng)處理及染色后檢查，見表5。結(jié)果表明，靜脈注射組內(nèi)臟畸形數(shù)與對照組相比差異有顯著性(P< 0.05)，皮下注射低劑量組與對照組相比，骨骼畸形數(shù)(率)及內(nèi)臟畸形數(shù)(率)均差異有顯著性(P< 0.01)。

3 討論

陽性對照組在藥物生殖毒性研究中有重要意義，可以驗證實驗動物、實驗人員、實驗條件、實驗環(huán)境等方面的穩(wěn)定性和可靠性。在家兔Ⅱ段生殖毒性研究中，陽性藥的選擇一直是研究的難點,它要求藥物能使兔胎仔產(chǎn)生盡可能多的畸形種類，但不能對母體產(chǎn)生較大的毒性。環(huán)磷酰胺是臨床上常用的一種抗腫瘤藥物和免疫抑制劑[7]，是研究最多的化學(xué)致畸劑之一，背景資料較多，經(jīng)常用于致畸、致突變研究，本研究亦采用環(huán)磷酰胺進行試驗[8]。

實驗室前期研究中，采用環(huán)磷酰胺分別于妊娠GD6、GD8、GD10按20 mg/kg耳靜脈推注給藥,兔胎仔外觀及骨骼、內(nèi)臟畸形均不明顯。可見選擇恰當(dāng)?shù)慕o藥時間和給藥方式是研究的重難點。本次研究設(shè)計了兩種給藥方式，即靜脈注射和皮下注射，分別于GD10 ～ 13給予不同劑量的環(huán)磷酰胺，觀察兔胎仔外觀、內(nèi)臟、骨骼畸形。結(jié)果表明，靜脈注射組外觀畸形率、內(nèi)臟畸形率與對照組相比均有顯著性差異；皮下注射低劑量組外觀畸形率、骨骼畸形率、內(nèi)臟畸形率與對照組相比均有極顯著性差異，且外觀畸形出現(xiàn)的種類較多；皮下注射高劑量組100%為吸收胎,可見該劑量不適宜制備家兔Ⅱ段生殖毒性陽性對照。

表4 環(huán)磷酰胺對兔胎仔體重、身長、尾長的影響±s)Tab.4 Effects of cyclophosphamide on body weight, body length and tail length of the rabbit litter

注：與生理鹽水對照組比差異有顯著性*P< 0.05，差異有顯著性**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, compared with the saline control group.

表5 環(huán)磷酰胺對兔胎仔外觀、骨骼、內(nèi)臟的影響Tab.5 Effects of cyclophosphamide on the appearance, skeleton and viscera of the rabbit litter

注：與生理鹽水對照組比差異有顯著性*P< 0.05，差異有顯著性**P< 0.01。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, compared with the saline control group.

本研究還對淘汰的三只孕兔于GD12單次靜脈給予環(huán)磷酰胺30 mg/kg，GD28解剖發(fā)現(xiàn)，該劑量下未產(chǎn)生母體毒性，胎仔100%產(chǎn)生外觀畸形，內(nèi)臟畸形率為36.36%，骨骼畸形率為54.54%。但由于樣本量較少，該陽性對照組模型的制備方法還有待于進一步研究驗證。

綜上所述，采用靜脈注射和皮下注射給藥，均使孕兔產(chǎn)生了不同程度的畸形，說明環(huán)磷酰胺用作兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗陽性對照藥物是可行的，且GD10 ～ 13皮下注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg給藥周期短，操作方便，吸收胎少，胎仔畸形率高，畸形種類多，對母體毒性小，可視為較理想的陽性給藥方法。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. 藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則 [S]. 2006: 1-28.

[2] 周莉，姜娟，王永，等. 環(huán)磷酰胺對新西蘭兔胚胎-胎仔發(fā)育的毒性作用研究 [J]. 藥物不良反應(yīng)雜志, 2013, 15(2): 87-92.

[3] 湯連升，張森，賈慶文. 靜脈注射注射用環(huán)磷酰胺對新西蘭兔胚胎-胎仔發(fā)育的影響 [A]. 2015年(第五屆)藥物毒理學(xué)年會[C], 2015: 138-139.

[4] 孫祖越，周莉，閆晗，等. 如何成功地開展藥物非臨床生殖毒性試驗 [J]. 中國新藥雜志, 2011, 20(22): 2195-2204.

[5] 袁伯俊，廖明陽，李波. 藥物毒理學(xué)實驗方法與技術(shù) [M]. 北京化學(xué)工業(yè)出版社, 2007.

[6] 周莉，孫祖越. 實驗用兔和大鼠常見畸形圖譜 [M]. 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2015.

[7] 管孝鞠，王治橋，廖明陽，等. 環(huán)磷酰胺致畸機理研究進展 [J]. 癌變畸變突變, 1998, 10(4): 256-264.

[8] 王聰，王一騰，魏鑫. 環(huán)磷酰胺的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀 [J]. 臨床和實用醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 7(8): 179.

·專家問答·

問：常見分子影像設(shè)備的應(yīng)用情況簡介

答：分子影像的應(yīng)用主要包括三方面：結(jié)構(gòu)性影像、功能性信息、細胞與組織代謝。對于結(jié)構(gòu)性影像來說，在臨床、臨床前多用CT或MR影像系統(tǒng)，MR還可以看功能性信息和少量代謝信息；對于細胞與組織代謝來說，在臨床、臨床前最具代表性的還是PET或SPECT影像系統(tǒng)，但由于這些系統(tǒng)需要使用核素，所以多在醫(yī)院使用，在實驗室使用不太方便，在高校活體光學(xué)應(yīng)用得最廣。當(dāng)然，每個設(shè)備、每個影像平臺都有其優(yōu)勢和不足。在分子影像平臺方面，活體光學(xué)在使用上還有一些限制，解決這些限制的一個辦法就是多模態(tài)方式的整合，比如活體光學(xué)與CT/MR的組合，PET與CT/MR的組合等類似的概念和邏輯。

(感謝第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心 師長宏 教授、

冷泉港生物科技股份有限公司分子影像部門副總經(jīng)理 王志宇先生 的解答)

Administration mode of cyclophosphamide for the embryo-fetaldevelopmental toxicity test in rabbits

KONG Fei-fei， ZHANG Tong， GONG Xia-shi， ZHANG Hang

(Hubei Institute Co., Ltd of Pharmaceutical Industry, Hubei Center for Drug Safety Evaluation, Wuhan 430061, China)

Objective To explore the effects of cyclophosphamide administered by different routes or in different doses on the embryo-fetal development in pregnant rabbits, and to determine the optimal mode of cyclophosphamide administration to induce fetal malformation. Methods Pregnant rabbits were divided into control group C (saline), group Y1 (intravenous injection of 15 mg/kg cyclophosphamide,), group Y2 (subcutaneous injection of low dose cyclophosphamide, 20 mg/kg), and group Y3 (subcutaneous injection of high dose cyclophosphamide, 30 mg/kg). Each rat was administrated according to the corresponding mode once daily on GD10～13. The day of conception was designated as GD0. The pregnant rabbits were sacrificed and dissected on GD28. Then, the number of corpora lutea and implantation, the weight of uterus with contained fetus, and fetal resorption rate were detected, the fetuses were removed and the fetal sex, body length, tail length, the number of live births and stillbirths were recorded, and the appearance of deformities, visceral deformities and skeletal malformations were detected. Results Pregnant rabbit fetuses in the cyclophosphamide intravenous injection group and subcutaneous injection of low dose cyclophosphamide group showed deformities. The appearance malformation rates in the two groups were 30.77% and 95.65%, the skeletal deformity rates were 7.69% and 73.91%, and the visceral abnormality rates were 20.51% and 47.83%, respectively. The fetal resorption rate in the high dose cyclophosphamide subcutaneous injection group was 100%. Conclusions Subcutaneous injection of 20 mg/kg cyclophosphamide to pregnant rabbits at GD10～13 can be used as a positive administrationmethod for rabbit embryo-fetal developmental toxicity test. Thismethod has the advantages of short administration period, easy operation, few fetus resorption, and high rate of fetal malformation, thus, providing the evidence for selection of appropriate model of rabbit embryo-fetal developmental toxicity.

Embryo fetal development; Fetal malformation; Cyclophosphamide; Rabbits

孔菲菲(1988-)，女，研究實習(xí)員，碩士，研究方向：生殖毒理學(xué)研究。 E-mail: wuhankff@sina.cn

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0093-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.017

2016-11-18