CYP11A1基因多態(tài)性與老年性骨質(zhì)疏松性骨折相關性研究

王其飛 劉正 劉家?guī)?宮雁冰 吳四軍 姚洪春 張昆 薛濤 張光武*

1. 北京大學首鋼醫(yī)院骨科，北京 100144 2. 北京大學首鋼醫(yī)院中心實驗室，北京 100144

老年性骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一種，又稱為Ⅱ型骨質(zhì)疏松癥，為低轉換型骨質(zhì)疏松癥，發(fā)病年齡一般在70歲以上[1]。該病受遺傳因素和環(huán)境因素共同影響，其中遺傳因素占80%左右[2]。目前已證實與骨質(zhì)疏松癥相關的候選基因有雌激素受體基因、維生素D受體基因、LRP5基因、OPG基因等。國外一項臨床研究[3]發(fā)現(xiàn)CYP11A1基因rs900798位點多態(tài)性與芳香酶抑制劑治療的絕經(jīng)女性骨量丟失有關，說明該基因位點在骨代謝調(diào)節(jié)中有潛在作用，但尚未有關于該位點與骨代謝標志物關系的報道。本研究探討CYP11A1基因rs900798位點與老年性骨質(zhì)疏松性骨折骨轉換標志物的關系，有助于從基因水平、骨代謝狀況闡明老年性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制，為預防和治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1一般資料：研究對象為來自2015年12月至2016年7月北京大學首鋼醫(yī)院住院部骨科病房、內(nèi)分泌病房和老年干部病房患者，共235人。老年性骨質(zhì)疏松性骨折患者(骨折組)121人，其中胸椎骨折、腰椎骨折、胸腰椎骨折、股骨頸骨折、粗隆間骨折、肱骨近端骨折和橈骨遠端分別為32例、40例、3例、19例、20例、4例和3例。骨折組中男性38人，女性83人；年齡65～96歲，平均(76.7±7.3)歲。老年性骨質(zhì)疏松癥患者(對照組)114人，其中男性41人，女性73人；年齡65～90歲，平均(72.0±7.4)歲。骨折組和對照組在性別、年齡和體重指數(shù)上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

表1 研究對象基本資料Table 1 Basic characteristics of

1.1.2納入標準：骨折組和對照組年齡≥65歲；符合骨質(zhì)疏松WHO診斷標準(T≤-2.5SD)；理解本研究目的及要求，同意參與本研究并簽署書面知情同意書。此外，骨折組為低能量損傷導致的骨折。

1.1.3排除標準：不能簽署知情同意書；近1年使用阿侖膦酸鈉或唑來膦酸等雙磷酸鹽類藥物，近6個月使用骨化三醇、雷洛昔芬、雌激素、降鈣素、活性維生素D等；近3個月進行2w以上影響骨代謝藥物，如類固醇類激素等；有嚴重肝、腎、胃腸等重要臟器疾??；患有影響骨代謝的疾病，如有糖尿病、甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺功能減退、垂體疾病等；存在影響骨密度(bone mineral density，BMD)測量的因素，如髖部或腰椎手術史；骨折組因BMD測量困難不能完成。

1.2 研究方法

1.2.1骨密度測定：骨密度測定采用雙能X線吸收儀完成，測量部位包括腰椎2-4、股骨頸和全髖。

1.2.2骨轉換標志物測定：采用全自動化學發(fā)光免疫分析法檢測研究組和對照組血清PINP、β-CTX濃度。

1.2.3SNP分型：清晨空腹時采集肘靜脈血2ml于EDTA抗凝管中，置于-80 ℃冰箱保存。采用酚/氯仿法提取外周血白細胞DNA, -20 ℃保存。上海生物工程技術有限公司合成CYP11A1基因rs900798位點引物，上游引物：5′- CCACTCTTGGAGCCCTTCTG-3′，下游引物：5′-GAGCTGGCAATGATGTGTCC-3′。采用SNaPshot技術基因分型。核心反應(即延伸反應)體系中包含：測序酶；四種熒光標記ddNTP；緊挨多態(tài)位點5′-端的不同長度延伸引物；包含SNP位點的PCR產(chǎn)物模板。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結果

235例研究對象SNP分型全部成功，SNP檢出率為100%。兩組等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

骨折組G、T等位基因頻率分別為40.1%、59.9%，對照組G、T等位基因頻率分別為38.2%、61.8%，兩組等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 等位基因頻率分布Table 2 Distribution of allele frequency

骨折組和對照組GG、GT、TT基因型頻率分別為14.9%、50.4%、34.7%和13.2%、50.0%、36.8%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 基因型頻率分布Table 3 Distribution of genotype frequency

骨折組血清PINP、β-CTX均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 兩組骨轉換標志物比較Table 4 Comparison of biochemical markers of bone turnover between the two groups

骨折組GT基因型血清PINP濃度大于GG基因型和TT基因型(P>0.05)，骨折組3種基因型血清β-CTX濃度大小依次為TT>GT>GG(P>0.05)(表5)。

表5 骨折組各基因型骨轉換標志物比較Table 5 Comparison of biochemical markers among genotypes in the fracture group

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是常見的全身性骨代謝疾病，主要特點為骨微結構破壞、骨量丟失、骨脆性增加和骨折風險增加。隨著社會老齡化的發(fā)展，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年上升，預計到2050年將增加到2.1億[1]。骨質(zhì)疏松性骨折危害極大，尤其是髖部骨折致殘率、致死率高，文獻報道髖部骨折后患者1年內(nèi)死亡率高達20%[4]，引起世界各國政府的高度關注。

CYP11A1基因屬于細胞色素P450超基因家族一員[5]，編碼膽固醇側鏈裂解酶，簡稱為P450scc。它是生物體內(nèi)類固醇激素合成第一步的限速酶[6]。P450scc在機體多個器官中表達。女性卵泡膜細胞中表達量增加，患者罹患多囊卵巢綜合征風險大大增加[7]。P450scc也在腦組織中表達，當表達量下降時黃體酮水平低下，而孕烯醇酮與腦細胞生長、發(fā)育和分化有關，導致自閉癥譜系障礙發(fā)生率上升[8]。關于CYP11A1基因與骨質(zhì)疏松研究報道并不多，目前國內(nèi)外僅有一篇相關報道。西班牙一項臨床研究[3]表明CYP11A1基因與骨代謝有關。該研究在新鮮骨組織和培養(yǎng)的成骨細胞中檢測到CYP11A基因mRNA表達，并通過蛋白質(zhì)印跡法在成骨細胞中檢測到CYP11A1基因編碼的人膽固醇側鏈裂解酶的兩個亞型。這表明CYP11A基因在骨代謝調(diào)節(jié)具有潛在作用。CYP11A1基因編碼P450scc催化膽固醇轉化為孕烯醇酮，是性激素合成的第一步。當機體衰退老化時，CYP11A1基因表達量下降，性激素合成水平大幅度下降。雌激素或雄激素抑制破骨細胞活性、生成的功能下降，骨吸收作用加強，同時骨骼成骨作用也加強，但骨吸收作用強于骨形成作用，骨量丟失，最終導致骨質(zhì)疏松[9-10]。所以在骨質(zhì)疏松患者尤其發(fā)生脆性骨折的人群，CYP11A1基因表達下降，骨組織骨代謝速度加快，血清骨轉換指標上升。

骨質(zhì)疏松癥的診斷標準依據(jù)骨密度檢測結果[11]，其優(yōu)點為精確度高，穩(wěn)定性好，但骨密度值不能反映骨代謝短期內(nèi)的病理生理變化。與骨密度相比，骨轉換標志物可早期評估骨質(zhì)疏松治療效果。在治療后數(shù)1～3個月后，骨轉換標志物就可發(fā)生改變。而骨密度變化一般在治療后1年以上才有較顯著的變化，可見骨密度具有明顯的滯后性[12]。本研究著重從基因與骨代謝轉換標志物關系進行探討。

檢測骨轉換標志物可評價骨代謝狀況，協(xié)助診斷代謝性骨病及分型，并可用于藥物療效的監(jiān)測[13]。骨轉換標志物包括骨形成標志物和骨吸收標志物兩類。前者代表成骨細胞活性及骨形成狀態(tài)，主要有骨鈣素(OC)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前膠原氨基端前肽(PINP)和Ⅰ型前膠原羧基端前肽(PICP)等。后者反映破骨細胞活性與骨吸收水平，主要包括Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)、吡啶啉(PYD)、脫氧吡啶啉(DPD)和抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP5b)等。國際骨質(zhì)疏松基金會推薦PICP和β-CTX作為骨質(zhì)疏松療效的檢測指標。它們分別為骨形成和骨吸收的首選骨轉換標志物[14]。PINP為I 型膠原合成過程中氨基端前肽切割后形成的片段。由于PINP 經(jīng)過肝臟代謝，故其水平受到肝功能影響。β-CTX 是I 型膠原降解后釋放入血的片段，經(jīng)腎臟排出體外。

高齡、低體重指數(shù)是骨質(zhì)疏松癥的危險因素[15]，但在本研究中人為控制研究對象一般資料，使骨折組和對照組在性別、年齡和體重指數(shù)上具有可比性。在本次研究中選擇髖部或脊柱骨折患者作為研究對象，他們在骨密度測定過程中疼痛增加，給骨密度測定帶來一定難度。經(jīng)患者及家屬同意給予肌肉注射鹽酸布桂嗪注射液30min后測量，不能堅持完成骨密度測定患者不納入本研究中。

骨折組和對照組的T等位基因頻率顯著大于G等位基因頻率，兩組等位基因頻率分布差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組基因型頻率GT>TT>GG，分布差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究所有研究對象的G、T等位基因頻率和GT、TT、GG基因型頻率分別為39.1%、60.9%和14.0%、50.2%、35.7%。而在Rodríguez-Sanz研究中，G、T等位基因頻率和GT、TT、GG基因型頻率分別為60.4%、39.6%和37.3%、46.2%、16.5%。兩個研究中該位點的等位基因頻率和基因型頻率分布明顯不同(P<0.05)，表明CYP11A1基因的rs900798位點分布具有種族、區(qū)域差異。骨折組血清骨轉換標志物PINP和β-CTX濃度大于對照組(P>0.05)，表明骨折組骨轉換過程活躍，骨形成和骨吸收過程都加強。血清PINP、β-CTX濃度可作為骨折風險的預測指標[16-18]。骨折組GT基因型PINP濃度顯著高于GG、TT基因型，表明GG基因型骨形成過程較GG、TT基因型強；而骨折組β-CTX濃度為TT>GT>GG，表明骨吸收作用依次減弱。濃度差異均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能與研究的樣本量較少有關。

本研究發(fā)現(xiàn)我國人群CYP11A1基因的rs900798位點等位基因頻率和基因型頻率與歐洲人群不同，說明該位點分布有種族和區(qū)域差異。但未發(fā)現(xiàn)老年性骨質(zhì)疏松性骨折患者不同基因型的血清PINP和β-CTX濃度差異有統(tǒng)計學意義，這可能與納入的研究對象較少有關。下一步筆者將擴大樣本量，在不同區(qū)域進行研究，為骨質(zhì)疏松癥的預防和治療提供理論依據(jù)。