五環三萜類化合物促進骨形成研究

吉璐宏 趙庭波

仙桃市第一人民醫院骨外二科，湖北 仙桃 433000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨組織微結構被破壞為特征的全身性骨骼代謝障礙性疾病，并容易發生脆性骨折[1]。據統計，我國60歲以上的人群其骨質疏松癥的發病率高達59%[2]，隨著我國人口老齡化進程的加快，骨質疏松患者將會越來越多[3]，這使得骨質疏松已成為一個社會性的健康問題。

在正常的情況下，骨組織和其他組織一樣有著穩定的代謝平衡，骨吸收與骨形成的速度大致相等，處于一個平衡狀態。然而，隨著年齡的增加造成生理性退化，使得這種平衡被打破，骨的吸收速度大于骨的形成，從而導致了骨質疏松[4]。因此，抑制破骨細胞的骨吸收和促進成骨細胞的骨形成是治療骨質疏松的兩種有效方法[5]。目前臨床上卻是以抗骨吸收類藥物為主，如雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調節劑等，雖然這些抗骨吸收類藥物能夠有效地防止骨骼進一步流失，但對增加骨的形成作用卻甚微。令人遺憾的是，具有促進骨形成作用的藥物卻只有甲狀旁腺激素(PTH-1)，而該藥物卻會增加患者患骨肉瘤發病率的風險[6]。因此，開發出新型、高效、低毒的促骨形成類藥物對治療骨質疏松有著重要意義。研究表明腸源性的血清素能夠抑制成骨細胞的分化、減少骨形成，而色氨酸羥化酶-1(TPH-1)是腸源性的血清素合成的限速酶，因此可以通過抑制TPH-1來調節血清素的合成能夠促進骨形成，達到治療骨質疏松的目的[7-9]。

五環三萜類化合物是一類在自然界中廣泛存在的天然產物，具有多種藥理活性如抗癌[10-11]、抗炎[12-13]、降血糖[14]等，且毒性低、不良反應少，具有良好的臨床開發潛力。最近研究表明五環三萜類化合物齊墩果酸(OA，圖1)也具有較好的抗骨質疏松的活性[15-16]，因此本研究繼續探討五環三萜其他類型化合物熊果酸(UA)、18β-甘草次酸(GA)、商陸酸(EA)、3-乙酰氧基-11-羰基-β-乳香酸(AKBA)、積雪草酸(AA)、雷公藤酮(TO)、白樺酸(BA)的促骨形成活性，以期得到抗骨質疏松活性更強、毒性更低的五環三萜類先導化合物。結果表明，測試的五環三萜類化合物對腸源血清素均有抑制作用，其中18β-甘草次酸展現出了最強的活性，并能顯著地促進成骨細胞增殖。

圖1 五環三萜類化合物的化學結構Fig.1 Structure of pentacyclic triterpenes

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑和細胞：五環三萜類化合物均購自北京百靈威科技有限公司，DMEM培養基、α-MEM培養基、胎牛血清購自Hyclone公司；色氨酸羥化酶-1 (TPH-1)ELISA試劑盒購自Cusabio公司；5-羥色胺 (5-HT)標準品購自上海上海生物科技有限公司；二甲基亞砜等其他試劑均為分析純；RBL-2H3細胞株購自上海細胞典藏中心，本實驗室凍存使用。動物：SD大鼠，體重200～250 g，雌性，由武漢大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SCXK (鄂) 2008-0004；動物級別：SPF級。

1.1.2儀器：Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FA1104N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；BB16/BB5060儀器CO2培養箱(上海力創科學儀器有限公司)；超凈工作臺(北京半導體設備一廠)；CKX31型倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；ELx800通用酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1腸源性血清素合成抑制測試：首先用HPLC對血清素(5-羥色胺，5-HT)標準品進行分析，確定其保留時間。5-HT的抑制率通過積分所得面積比，計算公式為：抑制率(%)=100% -測試化合物峰面積/對照組峰面積。取對數生長期的RBL-2H3細胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養基中，鋪至48孔細胞培養板中。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入200 μL的含有測試藥物(對照組不加藥物)的培養液培養2d后，棄去培養液，并用PBS洗滌，然后每孔加入100 μL 強裂解液RIPA裂解細胞，在加入200 μL PBS稀釋，離心后直接用HPLC測定5-HT的峰面積，并計算出藥物的對5-HT生物合成的抑制率。

1.2.2三萜類化合物對RBL-2H3細胞毒性的MTT檢測：為了進一步確證三萜類化合物是否因其內在毒性也影響血清素合成，接著采用MTT法測試三萜類化合物對RBL-2H3細胞的毒性。取對數生長期的測試細胞株懸浮于含10%的胎牛血清的DMEM培養基中，鋪至96孔細胞培養板中。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入100 μL的含有測試藥物的培養液培養2d后，每孔加入30 μL 5mg/mL MTT，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續孵育4 h，然后每孔加入100 μL二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標儀在570 nm波長處測定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.3三萜類化合物對TPH-1蛋白量的影響：用ELISA試劑盒，繪制TPH-1蛋白量-吸光度的標準曲線，再通過測試三萜類化合物與RBL-2H3細胞相互作用后的吸光度值計算出不同濃度三萜類化合物對應的TPH-1蛋白量，從而確定化合物對TPH-1蛋白量的影響。取對數生長期的RBL-2H3細胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養基中，鋪至24孔細胞培養板中。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入500 μL的含有測試藥物(對照組不加藥物)的培養液培養2 d后，棄去培養液，并用PBS洗滌，然后將細胞反復的凍融，收集裂解液用ELISA試劑盒測試，使用酶標儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.4三萜類化合物對TPH-1基因表達的影響：(1)總RNA提?。喝瞪L期的RBL-2H3細胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養基中，鋪至6孔細胞培養板中。待細胞完全貼壁后，加入不同濃度測試藥物(對照組不加藥物)的培養液培養2d后棄去原培養液，每孔加入1 mL Trizol試劑，吹打細胞，使細胞充分裂解；隨后，加入0.2 mL氯仿，室溫靜置5 min后離心15 min，將上層水相移置另一個1.5 mL無RNA酶的離心管中，并加入預冷的異丙醇(0.5 mL)沉淀RNA，離心后棄上清液，加入1 mL 75%的乙醇(0.1%DEPC水現配現用)，用移液器吹打乙醇，洗滌RNA沉淀，離心后棄上清液，將離心管倒置，室溫晾10 min后加入80 μL DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度計檢測RNA濃度值及OD260/OD280值，-80 ℃冰箱保存。(2)實時熒光定量PCR：首先登錄GenBank database和文獻查尋TPH-1基因序列[17]，并確定所用引物序列為5′-GAAGACGTGGGGAGTTGTGT-3′，5′-ACAGTGGAAA ACACGGAAGG-3′；接著以RNA為模板反轉錄出第一條cDNA鏈(5PrimeScriptTMBuffer (for Real Time) 2 μL；PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5μL；Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5μL；Random 6 mers (100 μmol/L) 2 μL；Total RNA 500 ng；補加Rnase Free dH2O水至10 μL。設定程序為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min)。隨后以cDNA為模板進行Real-Time PCR (SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL；PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL；PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL；ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL；DNA 模板 2 μL；ddH2O 6 μL。設定程序為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環，95 ℃ 20 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。

1.2.5體內抑制血清素的合成測試：將11w大的雌鼠分為給藥組[10 mg/(kg·d)組、20 mg/(kg·d)組、30 mg/(kg·d)組]、空白組和假手術組，每組5只。在摘除卵巢造模術后第4天開始灌胃給藥[陽性對照組腹腔注射20 mg/(kg·d)的PTH]，連續給藥35d后頸動脈取血。將血液在37 ℃下靜置45min后得到的血清用HPLC(104.6 mm，5μm C18柱)測試其血清素的含量；小腸則在酸化后測試其血清素，并用標準曲線定量。

1.2.6促進骨細胞增殖：將20只出生2～3d的乳小鼠斷頭處死，取出其頭蓋并刮去軟組織，放入10 mL 成骨細胞消化液中(0.1% collagenase+0.2% dispase+0.01M PBS+15%FBS的α-MEM培養基配置而成)，37 ℃消化15 min后取上清液，并于2000 rpm離心5 min收集細胞；隨后，將收集到的細胞接種到培養瓶中培養4d，洗去為貼壁的細胞，剩下的細胞即為成骨細胞；接著，取對數生長期的測試細胞株懸浮于含15%胎牛血清的α-MEM培養基中，鋪至96孔細胞培養板中。待細胞完全貼壁后，棄去原培養液，加入100 μL的含有測試藥物的培養液培養2d后，每孔加入30 μL 5mg/mL MTT，置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續孵育4 h，然后每孔加入100 μL二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標儀在570 nm波長測定每孔的吸光度(OD)值。

2 結果

2.1 體外抑制血清素合成

腸源性血清素主要由TPH-1合成，因此血清素的水平變化是TPH-1活性的重要指標。利用RBL-2H3(表達TPH-1)細胞來評價三萜類化合物抑制血清素的能力，結果如圖2所示。

圖2 五環三萜類化合物抑制腸源性血清素的合成作用Fig.2 Inhibitory effects of pentacyclic triterpeneson on serotonin biosynthesis

圖4 GA對TPH-1蛋白量的影響。A：TPH-1含量的標準曲線；B：GA在RBL2H3細胞中對TPH-1蛋白量的影響。每組數據都是 Fig.4 Effect of GA on the protein expression. (A) Standard curve for ELISA determination of TPH-1; (B) Effects of GA on the protein expression of TPH-1 in RBL-2H3 cells. Each value was expressed as means ± SD, n=4, *P< 0.01, **P< 0.05 vs controls (Con.)

2.2 體外抑制血清素合成的抑制活性

研究發現這些五環三萜類化合物對血清素均有一定程度的抑制作用，考慮到這些三萜類化合物有可能是通過其內在的毒性殺傷細胞而抑制血清素的合成，因此采用MTT法測試了這類化合物的毒性，其結果如圖3所示。

圖3 五環三萜類化合物對RBL-2H3細胞的毒性 Fig.3 Cytotoxicity of pentacyclic triterpenes on RBL-2H3 cells

2.3 18β-甘草次酸(GA)對TPH-1蛋白量的影響

通過體外活性實驗(圖2、3)表明，18β-甘草次酸(GA)能夠顯著地抑制血清素的合成，為了進一步確證GA對TPH-1蛋白的影響，采用了ELISA試劑盒檢測了GA在RBL-2H3細胞中對TPH-1蛋白量的影響，TPH-1蛋白量-吸光度的標準曲線和GA對TPH-1蛋白量的實驗結果如圖4所示。

2.4 18β-甘草次酸(GA)對TPH-1 mRNA表達的影響

通過體外活性實驗(圖4)表明，18β-甘草次酸(GA)能夠顯著影響RBL-2H3細胞中TPH-1蛋白量并呈劑量依賴關系。為了一步研究GA對TPH-1mRNA表達的直接影響，應用實時熒光定量GA對TPH-1 mRNA表達影響，其結果如圖5所示。

圖5 GA對TPH-1 m RNA表達的影響，對照組加入0.1% DSMO，數據表示倍數變化。每組數據都是 vs Controls (Con.) Fig.5 Effect of GA on the mRNA expression. Control group was treated with 0.1% of DMSO, and the data were expressed as a fold change. Each value was expressed as means ± SD, n=4, *P<0.01,**P<0.05 vs controls (Con.)

2.5 18β-甘草次酸 (GA)對OVX大鼠血清和腸中血清素的影響

體外活性測試表明GA能夠抑制血清素的合成，并且沒有毒性，為了進一步研究GA在動物體內是否也能夠有效地抑制血清素的合成，筆者采用了大鼠摘除卵巢(ovariectomized， OVX)的動物模型進行研究。灌胃給予摘除卵巢大鼠不同劑量的GA。實驗結束后用HPLC測定血清和小腸的血清素水平，標準曲線和實驗結果如圖6所示。

圖6 GA抑制體內血清素的合成。A：5-HT含量的標準曲線；B、C分別為假手術組(Sham)與摘除卵巢大鼠血清和小腸的血清素水平。每組數據都是 Fig.6 Effect of GA on serotonin biosynthesis in vivo. A: Standard curve of 5-HT; B (serum) and C (gut) serotonin levels of Sham-operated and ovariectomized (OVX) rats. Each value was expressed as means ± SD, n=4, #P< 0.05 vs Sham;*P< 0.01, **P< 0.05 vs OVX

2.6 18β-甘草次酸(GA)促進成骨細胞增殖

通過體外和體內研究發現GA能夠顯著地抑制血清素的合成，接著采用MTT法探討GA是否能夠促成骨細胞的增殖，其結果如圖7所示。

圖7 GA促進成骨細胞增殖效果。每組數據都是Fig.7 Stimulating effect of GA on osteoblast proliferation. Each value was expressed as means ± SD, n=3,*P< 0.01, **P< 0.05 vs controls (Con.)

3 討論

骨質疏松癥是成骨細胞和破骨細胞之間的動態平衡被打破，骨吸收超過骨形成所致。因此，促進成骨細胞的活性是治療骨質疏松癥的重要方法。本研究以色氨酸羥化酶-1 (TPH-1)為靶點，探討了具有廣泛生物活性的天然五環三萜類化合物對TPH-1的抑制活性以及成骨細胞的活性。從圖2腸源性血清素的抑制活性結果中可以看出這些五環三萜類化合物對血清素合成均有抑制作用，抑制率為3.6%～76.5%，并呈劑量依賴關系；但是三萜類化合物之間對血清素合成抑制作用卻有較大的差異。從結構上看，這些測試的化合物均是五環結構，但在環上有不同的取代基，正是這些取代基團的不同使得化合物對血清素合成展現出了不同程度的抑制作用；由這些基團與活性之間的關系可以初步得出五環三萜類化合物的構效關系。以齊墩果酸(OA)作為母體化合物，將其D環的一個甲基(-CH3)由C20位轉移到C19位(熊果酸，UA)能夠保留對血清素合成的抑制活性；進一步在熊果酸的C環引入α,β-不飽和酮(18β-甘草次酸，GA)能夠顯著地提高其活性，在30 μM的濃度下，GA對血清素的抑制率可達到76.5%；然而，在C3位引入取代基后卻降低了活性(OA vs EA；GA vs AKBA；UA vs AA)；同時，將α,β-不飽和酮由C環轉移到A環后也降低了活性(GA vs TO)；此外，將D環修由六元環修飾成五元環也將降低活性(OA vs BA；UA vs BA)。這些結果說明C環的α,β-不飽和酮是一個能夠抑制血清素合成的藥效團。事實上，在五環三萜類化合物的結構修飾中，C環的α,β-不飽和酮也能夠增強母體化合物的抗腫瘤、抗炎等活性；進一步研究發現五環三萜類化合物對血清素的抑制活性不是來源于其對RBL-2H3細胞的毒性，而是來源于其對TPH-1的抑制活性(圖3)，并能夠明顯地抑制TPH-1蛋白含量及其mRNA表達，并呈劑量依賴性(圖4、5)。在動物水平上，與Sham組相比，OVX組血清和小腸中血清素的水平明顯增高，而經過GA給藥后大鼠血清和小腸中血清素的水平卻明顯降低并呈現出劑量依賴性，尤其是在30 μM濃度下血清(426 ng/mL)和小腸(304 ng/mL)中血清素的濃度較OVX組(含量分別為1050 ng/mL和723 ng/mL)降低了大約2.4倍。這些結果說明GA在動物體內也能夠抑制血清素的合成(圖6)；隨后，在促進成骨細胞活性實驗中發現，與比空白組相比，GA能夠顯著地促進乳小鼠成骨細胞增殖，并呈劑量依賴性(圖7)。

綜上所述，色氨酸羥化酶-1(TPH-1)是治療骨質疏松癥的一個重要靶點，抑制TPH-1能夠抑制血清素合成的活性，并能夠促進成骨細胞的增殖，而五環三萜類化合物能夠有效抑制TPH-1并促進骨細胞的增殖，其中18β-甘草次酸(GA)可以作為治療骨質疏松癥的先導化合物進行更深入的研究。