Anti-CD11b單克隆抗體對超高分子聚乙烯磨損顆粒誘導骨溶解作用的研究

楊國曦 朱慶生 楊重飛

第四軍醫大學附屬西京醫院骨一科, 陜西 西安 710032

人工關節置換術是本世紀發展最成功的術式之一，然而，無菌性松動造成的術后翻修給患者造成生活質量的下降和經濟負擔[1]。作為人體內唯一具有骨吸收功能的細胞，破骨細胞對骨量的維持以及骨形態的塑造具有非常重要的作用[2-4]。假體磨損而產生的磨損顆粒可以促進破骨細胞的分化，造成假體周圍骨溶解，進一步發展則會引起無菌性松動的發生，并最終導致翻修，因此，研究破骨細胞分化的機制對無菌性松動的預防和治療具有十分重要的意義。破骨細胞由單核/巨噬細胞分化而來，其分化成熟的過程亦是細胞遷徙和融合的過程，巨噬細胞分化抗原-1(Macrophage differentiation antigen-1，Mac-1)分子作為整合素家族的重要一員，除了參與免疫應答和炎癥反應，也參與細胞間識別和信號轉導[5]。與Mac-1(CD11b/CD18)分子僅有一個亞基之差的LFA-1(CD11a/CD18)和血管內皮細胞表達的ICAM-1(CD54)的相互作用對破骨細胞的分化具有明顯的促進作用[6-8]，而目前尚無Mac-1在RANKL誘導下破骨細胞導致骨溶解的相關研究，因此，本實驗將通過建立超高分子聚乙烯磨損顆粒誘導的小鼠顱骨溶解模型，模擬無菌性松動的發生過程，并探討CD11b分子在顱骨溶解過程中發揮的作用及初步分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

C57BL/6J清潔級小鼠，10周齡，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。鱟試劑內毒素快速檢測試劑盒(Endosafe，美國)；超高分子聚乙烯(Ultrahigh molecular weight polyethylene，UHMWPE)磨損顆粒顆粒由德國ErnstKrendlinger教授惠贈(CeridustVP3610，Clariant，Gersthofen,Germany)50%的顆粒直徑小于5 μm，90%的顆粒直徑小于9 μm，平均直徑為1.68±1.32 μm；小鼠TNF-α ElISA試劑盒(R&D，美國)；anti-CD11b單克隆抗體(M1/70，Abcam，美國)，Syk抑制劑(P505-15,Selleck，美國)。顯微計算機體層攝影(General Electric Company，美國)；注射器；常規手術器械(手術刀、剪血管鉗等)。

1.2 方法

1.2.1動物模型建立：術前將UHMWPE磨損顆粒用700 mg/L乙醇洗滌24 h，采用鱟檢驗排除細菌內毒素水平超標，磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，干燥后用Co60照射消毒，并用PBS溶液稀釋為40 μg/mL懸濁液。

取10周齡雌性C57BL/6J小鼠32只，分為4組，每組8只，稱量體重并做標記。10%水合氯醛麻醉，經外耳根內側部連線的中點和眼眶后部連線的中點之間連線作矢狀位切口長約 1.5 cm，暴露額狀縫及人字縫間直徑約 1 cm 的顱頂骨面積，并保持骨膜完整性。空白對照組(A)隨即縫合不做任何處理(假手術組)；其余三組以暴露的矢狀縫中點為中心，在顱骨骨膜外移植20 μg UHMWPE磨損顆粒(0.5 mL 濃度為40 μg/mL的顆粒PBS懸濁液)，隨后間斷縫合。術后待小鼠清醒后送入飼養籠中，動物自由攝取食物和水，飼養于清潔動物房中。術后第二天開始進行藥物干預：空白對照組(A)灌胃生理鹽水，37.5 ml/kg，每日兩次，并尾靜脈注射PBS，10 ml/kg，每日1次；Syk抑制劑組(B)以灌胃針頭灌胃Syk抑制劑(P505-15)，15 mg/kg(濃度為0.4 mg/mL的P505-15生理鹽水溶液)，每日兩次，并尾靜脈注射PBS，10 ml/kg，每日1次；anti-CD11b單克隆抗體組尾靜脈注射anti-CD11b單抗，2 g/kg[9](濃度為200 mg/mL的抗體PBS溶液)，每日1次，并灌胃生理鹽水，37.5 ml/kg，每日兩次；顆粒組(D)灌胃生理鹽水，37.5 ml/kg，每日兩次，并尾靜脈注射PBS，10 ml/kg，每日1次。2周后，頸椎脫臼法處死小鼠，摘眼球取血，取出顱骨標本。血液離心后用TNF-αELISA試劑盒檢測TNF-α濃度，顱骨標本進行顯微CT掃描重建并檢測相同部位等面積感興趣區域(region of interest，ROI)的骨體積分數(bone volume fraction，BVF)，若BVF值低于空白對照組(P<0.05)，并具備明顯的骨溶解征象，則判定為建模成功。

1.2.2Western blot 分析：提取各組顱骨骨膜總蛋白。依次進行蛋白定量、電泳、轉膜和封閉，分別孵育兔抗小鼠一抗(1∶1 000)及羊抗兔二抗(1∶5 000)后，ECL發光液化學發光并顯影。采用Image J軟件進行掃描定量，計算各條帶灰度值，并分別除以內參β-actin灰度值，并將對照組設為參照。

2 結果

2.1 小鼠血清TNF-α濃度

空白對照組、anti-CD11b單克隆抗體組及Syk抑制劑組血清TNF-α值均低于顆粒組(P<0.05)。見表1。

2.2 顯微CT三維重建

建模小鼠全部存活，平均體重26.6 g。空白對照組圖像可見完整顱骨，未見顱骨溶解跡象；Syk抑制劑組骨溶解程度較顆粒組輕，只出現小部分缺損；anti-CD11b單克隆抗體組出現輕微顱骨溶解及骨缺損；顆粒組出現嚴重顱骨溶解，出現大面積缺損。見圖1。

組別(Group)濃度(μg/mL)(Concentration:μg/mL)空白對照組(Control)1.025±0.002Syk抑制劑組(Syk inhibitor group)1.145±0.003a,bAnti-CD11b單抗治療組(Anti-CD11b antibody group)1.202±0.002a,b顆粒組(Particles group)1.478±0.006a

注：a：與空白對照組相比結果具有統計學差異(P<0.05)；b：與顆粒組相比結果具有統計學差異(P<0.05)
a：P<0.05vscontrol,b:P<0.05vsparticles group

圖1 小鼠顱骨溶解模型顯微CT三維重建結果(圓形紅色區域為ROI)A：空白對照組; B：Syk抑制劑組; C：Anti-CD11b單克隆抗體組; D：顆粒組Fig.1 Micro—CT three-dimensional reconstruction of mouse osteolysis model (red circular area areas refer to ROI)A:Control, B:Syk inhibitor group, C:Anti-CD11b antibody group, D:Particles group

2.3 小鼠顱骨骨體積分數

顆粒組骨體積分數小于空白對照組(P<0.05),可知超高分子聚乙烯顆粒誘導的小鼠顱骨溶解模型建模成功；Syk抑制劑組、anti-CD11b單克隆抗體組骨體積分數大于顆粒組(P<0.05)，可知Syk抑制劑及anti-CD11b單克隆抗體均對顆粒誘導的顱骨溶解有一定的抑制作用。見表2。

2.4 western blot 分析

Syk抑制劑組及anti-CD11b單克隆抗體組Erk活性、c-fos及NFATc1表達均低于顆粒組而高于空白對照組(P<0.05)。見圖2，表3。

組別(Group)N骨體積分數(Bone volume fraction)空白對照組(Control)80.1402±0.0012Syk抑制劑組(Syk inhibitor group)80.1135±0.0009a,bAnti-CD11b單抗治療組(Anti-CD11b antibody group)80.0902±0.0010a,b顆粒組(Particles group)80.0602±0.0008a

注：a：與空白對照組相比結果具有統計學差異(P<0.05)；b：與顆粒組相比結果具有統計學差異(P<0.05)
a：P<0.05vscontrol,b:P<0.05vsparticles group

圖2 Western blot 結果Fig.2 Western blot results

表3 Western blot 半定量結果Table 3 Western blot semi-quantitative results

注：a：與空白對照組相比結果具有統計學差異(P<0.05)；b：與顆粒組相比結果具有統計學差異(P<0.05)，Erk: extracellular signal-regulated kinas,細胞外信號調節激酶,NFATc1: nuclear factor of activated T-cells-1,活化T細胞核因子1。
a：P<0.05 vs control,b:P<0.05 vs particles group，Erk: extracellular signal-regulated kinas，NFATc1: nuclear factor of activated T-cells-1.

3 討論

無菌性松動可引起關節置換術后疼痛和功能障礙，并最終導致翻修，是人工關節置換術后最重要的慢性并發癥之一[10]。盡管無菌性松動的發生受多種因素的影響，但磨損顆粒依然是其最重要的起始原因[11]，金屬對UHMWPE是目前人工關節假體摩擦界面中最主要的一種，所產生的UHMWPE磨損顆粒也是臨床上最常見的磨損顆粒之一[10]，在無菌性松動的病理發展過程中，磨損顆粒刺激多種細胞因子的分泌，例如TNF-α、IL-1和IL-6，進而促進破骨前體細胞的募集、分化、激活和存活，導致假體周圍骨溶解的發生[10]，最終降低假體生存率。

CD11b是構成Mac-1分子的兩種亞基之一[12-14]，而位于破骨前體細胞表面的Mac-1分子具有多種功能：第一，介導白細胞與NK細胞的游走與滲出；第二，介導白細胞與NK細胞對iC3b調理的微生物或靶細胞的細胞毒功能；第三，結合胞外多種糖蛋白分子，介導跨膜傳導，影響破骨細胞的分化[15]。在Mac-1介導的細胞粘附和信號傳導中，CD11b亞基起到主導作用，而不是另一亞基CD18[16]，因此推測anti-CD11b單克隆抗體可能影響顆粒誘導骨溶解的病理過程。在破骨細胞分化的初期階段，Mac-1介導的信號轉導在破骨前體細胞分化至抗酒石酸磷酸酶陽性及細胞遷徙到融合階段都具有非常重要的作用[17]，該分子通過胞漿部分免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)調節銜接蛋白DAP(DNAX-activating protein，DNAX活化蛋白)12 和FcRγ(Fc receptorγ，Fc受體γ)傳遞信號激活Syk通路，從而進一步激活Ca2+信號，上調NFATc1轉錄因子，促進破骨細胞的形成[18]。本實驗中anti-CD11b單克隆抗體組及Syk抑制劑組骨體積分數較顆粒組高，說明anti-CD11b單克隆抗體及Syk抑制劑對顆粒誘導的骨溶解具有抑制作用，而western blot結果顯示anti-CD11b單抗或Syk抑制劑處理均導致Syk下游Erk通路相關蛋白表達下調，說明CD11b分子通過激活下游Syk通路促進破骨細胞分化。

TNF-α是由單核細胞、巨噬細胞以及T細胞分泌的一種細胞因子，病原體、內毒素等物質可以刺激該因子的產生。在骨代謝和炎癥性骨病中，TNF-α促進破骨細胞的分化和存活，扮演著十分重要的角色。Christine Lau等[19]發現，Syk通過調控p38的磷酸化，參與核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)轉錄因子的激活，最終促進TNF-α的分泌，在炎癥的產生中發揮重要作用。Shinohara H等[20]發現依賴雙鏈RNA的蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)在TNF-α刺激的破骨細胞分化過程中具有十分重要的地位，通過對RAW264.7細胞系的研究發現，經TNF-α處理后，破骨細胞內PKR升高，而PKR特異性抑制劑處理破骨前體細胞后，TNF-α所引起的促破骨細胞分化作用被減弱了，且這種作用是通過降低NFATc1而引起的。同時，TNF-α可以增加破骨前體細胞表面RANK的表達，同時激活基質細胞和骨基質脂肪細胞分泌RANKL[21]，而RANKL和RANK的相互作用促進了破骨細胞的分化過程[22, 23]，進一步說明TNF-α具有促進破骨細胞分化，進而加劇骨溶解的作用。在外界環境所導致的炎癥刺激下，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，iNOS)和NO生成增加，在TNF-α刺激下，iNOS在mRNA水平和蛋白質水平均明顯上升，同時，在細胞包漿內和培養基中均檢測到NO升高，Lee SK等[24]發現iNOS特異性抑制劑可以抑制TNF-α對破骨細胞存活的促進作用，同時增加培養基內NO濃度可以緩解這種抑制作用，這表明TNF-α通過增加破骨細胞內iNOS的表達，增加NO的產生，進而促進破骨細胞的存活。TNF-α亦可以通過Erk1/2 p44 途徑誘導破骨前體細胞表面Mac-1 分子的表達上調，并介導其向慢性炎癥反應部位游走[25]，而Mac-1的CD11b亞基可以通過激活Syk通路促進破骨細胞的分化，由此說明TNF-α不僅發揮促破骨細胞形成的作用，同時可以上調CD11b分子，協同刺激破骨細胞成熟。本實驗中，顆粒組小鼠血清TNF-α較其余三組升高，提示UHMWPE顆粒刺激機體產生了炎癥反應，促進骨溶解的發生，而Syk抑制劑組及anti-CD11b單克隆抗體組小鼠血清TNF-α較顆粒組小鼠降低，說明anti-CD11b單克隆抗體可以通過下游Syk通路抑制TNF-α的產生，降低該細胞因子對破骨細胞分化及存活的促進作用，協同anti-CD11b抗體本身所發揮的阻礙破骨細胞分化效應，最終共同抑制了磨損顆粒誘導的骨溶解。

綜上所述， anti-CD11b單克隆抗體通過封閉CD11b分子，干擾Syk通路的激活并降低TNF-α的產生，使破骨細胞分化受阻，最終抑制UHMWPE磨損顆粒誘導的骨溶解，提示CD11b分子或可作為關節置換術后無菌性松動的潛在治療靶點。