恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠情志與海馬區去甲腎上腺素和腎上腺素水平的相關性研究

李新民，楊麗萍，萬海嬌，朱江慧，侯俊林，詹向紅

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·論著·

恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠情志與海馬區去甲腎上腺素和腎上腺素水平的相關性研究

李新民，楊麗萍*，萬海嬌，朱江慧，侯俊林，詹向紅

目的 探討妊娠期恐傷刺激對其80日齡仔鼠情志和海馬區去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(EP)的影響，并探討兩者的相關性。方法 2015年1月—2016年3月，選取80日齡SPF級Wistar大鼠59只(雌鼠34只，雄鼠25只)，采用Morris水迷宮實驗評價其認知水平。選取認知基線水平一致的30只雌鼠按照隨機數字表法分為模型組和對照組，各15只，另選取認知基線水平一致且體格較強壯的15只雄鼠作為交配鼠。剩余雄鼠均作電擊鼠用，剩余雌鼠備用代替不孕鼠。運用旁觀電擊法建立妊娠期恐傷大鼠動物模型。仔鼠延續母鼠分組，至80日齡時采用隨機數字表法選取15只進行實驗。采用曠場實驗、糖水偏好實驗、懸尾實驗評價仔鼠情志；通過腦立體定位儀在右側海馬區采集腦透析液，應用高效液相色譜-電子俘獲檢測(HPLC-ECD)法檢測NE和EP水平。結果 模型組曠場實驗水平得分、垂直得分，糖水偏好實驗糖水消耗量、糖水偏好值均低于對照組，懸尾實驗靜止不動時間長于對照組(P<0.05)。模型組各灌流時間點海馬組織NE、EP水平均低于對照組(P<0.05)。仔鼠海馬組織NE水平與曠場實驗水平得分、垂直得分以及糖水偏好實驗糖水偏好值呈正相關,與懸尾實驗靜止不動時間呈負相關(P<0.05)。仔鼠海馬組織EP水平與曠場實驗水平得分以及糖水偏好實驗糖水偏好值呈正相關,與懸尾實驗靜止不動時間呈負相關(P<0.05)。結論 恐傷孕鼠可改變其80日齡仔鼠的情志及海馬區NE和EP的水平，其情志改變與海馬區NE和EP的水平密切相關。

精神障礙；妊娠；去甲腎上腺素；腎上腺素；情志

李新民，楊麗萍 ，萬海嬌，等.恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠情志與海馬區去甲腎上腺素和腎上腺素水平的相關性研究[J].中國全科醫學，2017，20(23)：2875-2878.[www.chinagp.net]

LI X M,YANG L P,WAN H J,et al.Correlation of emotional changes with norepinephrine and epinephrine in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats of fear-impaired pregnant rats[J].Chinese General Practice，2017，20(23)：2875-2878.

去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(EP)的涌現以及恐懼、憤怒情緒可作為精神異常的標志[1]，在應激狀態下，腎上腺中NE和EP水平發生改變，說明應激過程中有下丘腦-垂體-腎上腺系統的參與[2]，可見精神異常與NE、EP水平緊密相關。而這種緊密的聯系是否能夠進行母子傳遞，依然是尚需解決的問題。本研究應用微透析技術考察恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠海馬區NE和EP水平，以揭示其與仔鼠情緒異常的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 2015年1月—2016年3月，選取80日齡SPF級Wistar大鼠59只，其中雌鼠34只，體質量220～250 g；雄鼠25只，體質量250～290 g。Wistar大鼠均由山東魯抗公司提供，實驗動物合格證編號SCXK(魯)20140001。本研究獲得河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立 采用Morris水迷宮實驗評價大鼠認知水平，選取基線水平一致的雌鼠按照隨機數字表法分為模型組和對照組，各15只，另選取基線認知水平一致且體格較強壯的15只雄鼠作為交配鼠。剩余雄鼠均作電擊鼠用，剩余雌鼠備用代替不孕鼠。

采用旁觀電擊法建立孕期恐傷大鼠動物模型[3]。自制交流箱參照Communication Box System改進，由45 cm×45 cm×30 cm有機玻璃組成，室內采用有機玻璃板分為9個15 cm×15 cm×30 cm小室，小室之間有機玻璃板上有若干直徑為1 cm小孔，既可供旁觀鼠逃避電擊攀爬，又可使旁觀鼠通過視覺、聽覺、嗅覺獲得臨近大鼠的恐懼信息。底部由直徑3 mm、間隔11 mm的不銹鋼絲組成，可以連接調壓器給予大鼠足底電擊。放置電擊鼠的中央小室及四角小室15 cm高處加隔板進行束縛，使其不能逃避足底電擊，而放置旁觀鼠的其余4個小室不加隔板。

模型制備方法：自造模第1天9：00將電擊鼠和旁觀鼠放入自制交流箱相應的小室內，秒表定時165 s，結束后鳴響15 s，鳴響時段給予瞬時25～35 V電刺激6～8次，重復10次/d,持續至孕第19天。旁觀鼠可通過攀爬逃避電擊，電擊鼠卻因受到上部隔板的束縛遭受電擊而表現為尖叫、跳躍、大小便失禁，從而使旁觀鼠通過視覺、聽覺、嗅覺產生恐懼的心理反應。

各組雌鼠從電擊第15 d起9：00按雌雄2∶1合籠，次日7：00檢查受孕情況。雌鼠陰道口內有乳白色的陰栓，即可判定為受孕，記為孕第1天，如未發現陰栓可采用陰道涂片法進一步檢測。仔鼠延續母鼠分組，按隨機數字表法從出生的仔鼠中每窩抽取5只繼續飼養，至80日齡時再按隨機數字表法各抽取15只進行實驗。

1.2.2 曠場實驗 敞箱箱體為100 cm×100 cm×50 cm規格，周壁為黑色，底面由白色粉筆將其等分為25個方塊。每只仔鼠觀察5 min，經過底面方格為水平運動，以四只爪均進入該方格為標準，記1分；直立次數為垂直運動，以兩只前爪全部離地為標準，記1分；記錄仔鼠曠場實驗期間的清潔次數與大便粒數。

1.2.3 糖水偏好實驗 實驗前先讓仔鼠適應蔗糖水，第1個24 h給予仔鼠兩瓶1%庶糖水，第2個24 h給予仔鼠1瓶純水和1瓶含1%蔗糖水，每12 h將蔗糖水和純水互換位置，以免由于動物習慣性行為對實驗結果造成影響。禁食禁水12 h，每籠1只仔鼠，放置兩瓶已經稱重的水(1瓶純水，1瓶1%蔗糖水)，測量1 h內仔鼠飲糖水量及糖水偏好情況，糖水偏好值=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.2.4 懸尾實驗 采用自制懸尾實驗操作箱體，用繩子在距離尾尖部4 cm處系住，頭部離箱體底部約6 cm。將仔鼠懸掛2 min后開始觀察，持續觀察4 min，記錄靜止不動時間，即懸掛時停止掙扎，或僅有細小肢體動作的時間。

1.2.5 海馬區NE和EP水平檢測 麻醉仔鼠，頭部剃除毛發后，固定在腦立體定位儀上，定位仔鼠右側海馬區，選取的坐標分別為A：-2.8 mm，L：+3.0 mm，V：3.4 mm；A：-5.2 mm，L：+5.0 mm，V：6.5 mm，植入套管、探針，微量注射泵設定流速為1.5 μl/min，透析液收集到自動采樣器的一次性EP管內，自動采樣器溫度設置為4 ℃，自灌流80 min后每20 min收集一管，共6管。收集完畢直接用高效液相色譜-電子俘獲檢測(HPLC-ECD)法(ultimate3000高效液相系統，廠商：Thermo scientific；6041RS電化學檢測器安培池，廠商：Thermo scientific)進行檢測，若未及時檢測放入-80 ℃冰箱內保存。

精密稱取NE和EP各0.5 mg，置于10 ml定量瓶中，用林格液定容至10 ml制成母液，將母液分別稀釋并混合，最后制成濃度為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 ng/ml的梯度混合對照品液，置于-80 ℃冰箱保存。

色譜條件：流動相A為磷酸二氫鈉100 mmol/L，枸櫞酸鈉50 mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA) 50 μmol/L，辛烷磺酸鈉1.7 mmol/L，氯化鉀2 mmol/L，流動相B為乙腈，A∶B=90∶10。設定流動相流速為0.125 ml/min，柱溫30 ℃。電化學檢測器應用玻碳工作電極，工作電壓為520 mV，增益為10 nA，進樣量為20 μl。

2 結果

2.1 曠場實驗 兩組清潔次數、大便粒數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組水平得分、垂直得分均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組仔鼠曠場實驗結果比較

2.2 糖水偏好實驗 模型組糖水消耗量、糖水偏好值均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 懸尾實驗 對照組與模型組仔鼠懸尾實驗靜止不動時間分別為(117.6±17.1)、(161.8±30.9)s，差異有統計學意義(t=4.849，P<0.05)。

Table 2 Comparison of sucrose preference test in two groups of neonatal rats

組別例數糖水消耗量(g)糖水偏好值(%)對照組157.4±1.377.4±7.3模型組154.4±1.153.2±9.6t值6.9527.739P值<0.001<0.001

2.4 NE水平 模型組各灌流時間點海馬組織NE水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table 3 Comparison of NE levels in the hippocampal tissue of two groups of neonatal rats at different perfusion time points

組別例數80min100min120min140min160min180min對照組1514.49±3.8815.09±3.1915.29±2.8616.18±4.0316.60±3.0316.58±3.03模型組157.10±3.026.97±3.187.36±3.227.42±3.157.17±3.277.62±3.62t值5.8216.9827.1316.6338.1937.351P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5 EP水平 模型組各灌流時間點海馬組織EP水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

Table 4 Comparison of EP levels in the hippocampal tissue of two groups of neonatal rats at different perfusion time points

組別例數80min100min120min140min160min180min對照組1513.58±3.8513.88±3.9414.18±3.8813.84±4.4813.90±4.3013.74±4.22模型組154.53±2.414.23±2.084.47±2.264.50±2.394.41±2.284.09±2.36t值7.7178.3898.3757.1247.5527.730P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.6 相關性分析 仔鼠海馬組織NE水平與曠場實驗水平得分、垂直得分以及糖水偏好實驗糖水偏好值呈正相關,與懸尾實驗靜止不動時間呈負相關(P<0.05)。仔鼠海馬組織EP水平與曠場實驗水平得分以及糖水偏好實驗糖水偏好值呈正相關,與懸尾實驗靜止不動時間呈負相關(P<0.05，見表5)。

3 討論

本研究采用曠場實驗評價仔鼠在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度，模型組水平得分、垂直得分均降低，自主探究行為減少，緊張增加；模型組仔鼠糖水消耗量減少、糖水偏好值降低，反映其快感缺失；模型組仔鼠懸尾實驗靜止不動時間延長，提示妊娠期驚恐刺激可導致仔鼠在成長過程中出現絕望狀態。行為學實驗結果提示，妊娠期驚恐刺激對子代的情志有確切的不良影響，且影響較為持久，而這種母子間的情志傳代，與既往研究結果一致[4]。

表5 仔鼠行為學實驗結果與海馬組織NE、EP水平的相關性分析

Table 5 Correlation analysis of behavioral experimental results and levels of NE and EP in the hippocampus of neonatal rats

行為學實驗NEEPr值P值r值P值曠場實驗 水平得分0.4190.0210.4010.028 垂直得分0.3760.0410.3550.054糖水偏好實驗 糖水偏好值0.705<0.0010.726<0.001懸尾實驗 靜止不動時間-0.5060.004-0.5410.002

注：NE=去甲腎上腺素，EP=腎上腺素

孕母和胎兒無直接神經聯系，母體在應激狀態下腎上腺皮質產生NE和EP[5]，而從母體循環到胎兒大腦的應激激素主要是腎上腺皮質激素[6]。孕母妊娠期受應激干預，可引起新生兒行為神經評分顯著降低，臍帶血促腎上腺皮質激素、NE和EP水平升高[7]。而這與胎盤NE轉運蛋白清除NE的能力降低有一定的關系[8]。此為胎兒期和新生兒期血中應激激素NE和EP的水平變化提供有力依據。

本研究追蹤恐傷孕鼠子代遠期海馬區應激激素NE和EP水平，以期找到其與情志異常的關系。海馬區是調節焦慮、抑郁情緒的重要結構，是應激效應和高水平皮質激素最易損傷的部位，海馬區分泌NE和EP的減少導致了模型組仔鼠情志和認知的發育障礙。恐傷孕鼠對子代海馬區NE和EP水平的影響以及與情志異常的相關性，與慢性應激大鼠所致子代海馬區NE和EP水平的異常以及其與情志異常的相關性，具有高度一致性[9]。亦有研究表明，妊娠應激母鼠所產仔鼠在青春期前卵巢NE水平降低，可能是由于交感神經發育低下，以代償母代妊娠應激反應長期增加NE水平，延緩大鼠繁殖能力，這一機制可部分解釋恐傷孕鼠NE和EP水平降低的發生原因，也是情志異常發生的物質基礎[10]。

本研究闡明了恐傷孕鼠所產80日齡仔鼠情志與海馬區NE和EP水平的密切相關，但其進一步的分子生物學機制尚需進一步研究。

作者貢獻：楊麗萍、詹向紅進行文章的構思與設計；李新民、楊麗萍進行研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，并監督管理；萬海嬌、朱江慧進行數據收集；萬海嬌進行數據整理、統計學分析；李新民進行結果的分析與解釋、論文撰寫和修訂；侯俊林負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Correlation of Emotional Changes with Norepinephrine and Epinephrine in the Hippocampus of 80-day-old Neonatal Rats of Fear-impaired Pregnant Rats

LIXin-min,YANGLi-ping*,WANHai-jiao,ZHUJiang-hui,HOUJun-lin,ZHANXiang-hong

DepartmentofIntegratedChineseandWesternBasicMedicine,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046，China

*Correspondingauthor：YANGLi-ping，Professor；E-mail：bioylp@126.com

Objective To investigate the status of emotion and norepinephrine (NE) and epinephrine(EP) in the hippocampus of 80-day-old neonatal rats of fear-impaired pregnant rats,and to study the correlation of emotional changes with NE and EP.Methods This study was conducted from January 2015 to March 2016.Fifty-nine 80-day-old SPF Wistar rats(34 females and 25 males) were selected, and Morris water maze test was used to evaluate the cognitive level.Of them,30 females with the same cognitive level were selected and divided into the model group and control group by the random number table with 15 in each,15 strong males with the same cognitive level were selected as mating rats.The other male rats

electric shocks, while the other female rats were reserved to replace sterile rats.Fear-impaired pregnant rats were established by watching other rats being shocked by electricity.The neonatal rats were divided by the same method used by the fear-impaired pregnant rats and 15 of them were randomly selected for experiment on the 80th day after birth.Emotional changes in them were observed by open field test,sucrose preference test and tail suspension test.Brain microdialysis of the right hippocampus was collected with the stereotaxis instrument to determine the level of NE and EP by HPLC-ECD.Results Compared with the control group,the scores of horizontal and vertical movements,consumption of sucrose and sucrose preference value of the 80-day-old rats in the model group were decreased,while the immobility time was increased (P<0.05); levels of NE and EP in the hippocampus of 80-day-old rats in the model group were decreased at different liquid perfusion time points (P<0.05).The level of NE in the hippocampus of the 80-day-old rats presented a positive correlation with the scores of horizontal and vertical movements,and sucrose preference value,while it showed a negative correlation with the immobility time (P< 0.05).The level of EP in the hippocampus of the 80-day-old rats was positively correlated with the score of horizontal and vertical movements and sucrose preference value,while it was negatively correlated with the immobility time (P<0.05).Conclusion Fear-impaired pregnant rats change the emotion,and influence the level of NE and EP in the hippocampus in 80-day-old neonatal rats,and the emotional changes are closely related with NE and EP in the hippocampus.

Mental disorders；Pregnancy；Norepinephrine；Epinephrine；Emotion

國家自然科學基金面上項目(81373790)

R 74

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y40

2016-12-18；

2017-06-14)

450046河南省鄭州市，河南中醫藥大學中西醫結合基礎學科

*通信作者：楊麗萍，教授；E-mail： bioylp@126.com