響應面法優化柑橘黃豆醬的制曲工藝

彭銘燁，周夢舟，付彩霞，李冬生，徐寧*

(1.湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；2.湖北土老憨調味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

響應面法優化柑橘黃豆醬的制曲工藝

彭銘燁1，周夢舟1，付彩霞2，李冬生1，徐寧1*

(1.湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；2.湖北土老憨調味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

以優化柑橘黃豆醬的制曲工藝為目標，選取橘粉添加量、菌種復配比、制曲時間為影響因素，采用成曲中總黃酮含量為指標進行研究。在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken中心組合設計原理和響應面法，建立回歸方程預測模型，得到最優的制曲條件：橘粉添加量10%，菌種復配比3∶1，制曲時間44 h。該條件下測得成曲中總黃酮含量為0.4 mg RE/g，與理論值的相對誤差只有0.5%。

柑橘粉；米曲霉；黑曲霉；制曲；總黃酮

豆醬又稱大豆醬、豆醬，是指利用米曲霉等微生物發酵黃豆而制成的醬制品，是我國傳統的發酵調味品[1]。

而制曲是黃豆醬制作的一個關鍵過程，成曲的好壞會直接影響黃豆醬的品質。在黃豆醬制曲過程中，諸多因素會對成曲的質量造成影響，比如原料的配比、菌種的接種量、菌種的復配比以及制曲的時間等均會影響成曲的品質。

柑橘是我國南方主要的水果之一，由于色、香、味兼備，爽口清香，甜爽多汁，風味醇厚，營養豐富，深受人們喜愛[2]。但是柑橘生產加工過程中伴隨大約30%的皮等副產物的生成，大部分都被直接作為生活垃圾處理，對環境造成嚴重污染[3]。而柑橘皮中含有大量生物活性物質，這些物質不僅可以抗炎[4-7]，還可以降血脂[8,9]和調節新陳代謝[10-13]。因此，本研究根據影響醬油制曲的主要因素進行試驗，在單因素試驗的基礎上，以成曲中總黃酮的含量為響應值進行響應面試驗，得到柑橘曲料制備的最優工藝，為制備高抗氧化活性的保健曲料提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮柑橘皮 湖北土老憨生態農業集團；大豆、面粉 市售；米曲霉AS 3.951(滬釀 3.042) 湖北省食品發酵工程技術研究中心。

氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、甲醇 國藥集團化學試劑有限公司；蘆丁(99%) 阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

MJX-280HM菌培養箱 寧波萊福科技有限公司；WFJ2000紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；YXQ-SG41-280-B高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫用核子儀器廠；Biosafer-10D 臺式凍干機 賽飛(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備橘粉

將新鮮的柑橘皮于-18 ℃下冷凍48 h，然后將柑橘皮置于冷凍干燥機托盤上，冷凍干燥24 h，最后將干燥后的柑橘皮進行粉碎并通過120目的網篩，得到橘粉。

1.3.2 工藝流程

橘粉 種曲(米曲霉和黑曲霉)

↓ ↓

黃豆 → 潤水 → 蒸煮 → 冷卻 → 面粉→ 接種 → 制曲 → 成曲。

1.3.3 制曲

曲料配方：黃豆∶面粉為7∶3(m/m)，實驗組采用橘粉替代部分面粉。黃豆經浸泡后，121 ℃蒸壓20 min，冷卻后拌入面粉并接入種曲0.3% (m/m)，拌勻。制曲室34 ℃培養10～12 h，松曲1次。接著控溫32～35 ℃，19～22 h第2次松曲。最后調節培養溫度28～30 ℃，保持該溫度至制曲結束。

1.3.4 單因素試驗

選取橘粉添加量、菌種復配比和制曲時間3個因素，依據表1中的因素水平和試驗條件采用1.3.3的方法制備曲料，然后檢測成曲中總黃酮的含量，考察以上因素對成曲中總黃酮含量的影響，每個試驗重復3次，取平均值。

表1 單因素試驗條件Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.5 制曲工藝最優參數的確定

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken試驗設計原理[14]，設計三因素三水平響應面分析試驗，其因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface test

1.3.6 總黃酮的提取及含量測定

總黃酮的提取方法參考Xu等[15]的報道，稱取10 g冷凍干燥的成曲樣品，溶于100 mL 80% (V/V) 甲醇溶液中并于室溫下超聲15 min，10000 r/min離心10 min。殘余物繼續用上述方法提取，共提取3次，合并3次離心所得的上清液，該溶液用于測定總黃酮的含量。

總黃酮的含量測定方法參考黃健蓉等[16]的報道，即1 mL上清液用去離子水稀釋至5 mL，然后向溶液中加入0.3 mL 5% (m/V) NaNO2溶液。5 min后，加入0.3 mL 10% (m/V) Al(NO3)3溶液，放置6 min后，繼續添加2 mL 1 mol/L NaOH，然后用去離子水定容到10 mL。在510 nm條件下使用紫外可見分光光度計測定各個組分的吸光值，空白對照為未添加樣品的溶液和水混合體系。選取0，0.1，0.2，0.3,0.4，0.5, 0.6 mg/mL的蘆丁來繪制相應的標準曲線。總黃酮含量用蘆丁當量RE/g表示，每個平行重復3次實驗。

1.4 數據分析

實驗數據用Design Expert 8.0.5b，Excel 2013及SPSS軟件處理，差異顯著性水平P<0.05，平均數之間的比較采用極差檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 橘粉添加量對成曲中總黃酮含量的影響

圖1 橘粉添加量對成曲中總黃酮含量的影響

注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，空白表示只接種米曲霉制曲，下同。

據分析，柑橘皮中除了含有纖維素、木質素以及豐富的微量元素外，還含有大量的黃酮類物質，而黃酮類物質具有較強的抗氧化活性[17]。制曲中橘粉的加入不僅可以提高成曲的品質，還可以增加其風味和保健功效。Xu等研究發現市售醬制品中總黃酮的含量范圍在0.17～1.23 mg RE/g。

由圖1可知，在橘粉添加量為10%時，成曲中總黃酮的含量最高，可達到0.4 mg RE/g，與對照組相比提高了15%。但當橘粉添加量為15%時，成曲中總黃酮比對照組降低了20%。由此可知，橘粉加入量過大會抑制微生物的生長，從而影響蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等各種酶的分泌，造成成曲中黃酮類物質含量降低。故選定橘粉添加量為3%，7%和10%進行響應面優化試驗。

2.1.2 菌種復配比對成曲中總黃酮含量的影響

圖2 菌種復配比對成曲中總黃酮含量的影響

多菌種耦合制曲不僅可以彌補米曲霉單菌種制曲存在的酶系不足、成曲品質一般、抗氧化活性物質低等缺陷，還豐富了發酵的酶系，提高了成曲中總黃酮含量，對成曲品質的提高有積極意義。

由圖2可知，當米曲霉與黑曲霉的比例為2∶1接種制曲時，成曲中總黃酮的含量為0.26 mg RE/g，與對照組相比減少了24%。而隨著黑曲霉所占比例不斷降低，成曲中總黃酮的含量不降反增，在米曲霉與黑曲霉的比例為3∶1時可使成曲中總黃酮的含量達到最大。故選取菌種復配比為3∶1，4∶1和5∶1進行響應面優化試驗。

2.1.3 制曲時間對成曲中總黃酮含量的影響

圖3 制曲時間對成曲中總黃酮含量的影響

在制曲過程中，菌種需要一定時間的萌發，從而才能在培養基中生長出孢子和菌絲，制曲時間過短，會導致菌絲生成不足，總黃酮含量較低，影響成曲的品質；而制曲時間過長，可能會滋生更多的雜菌，導致成曲質量降低。

由圖3可知，當制曲時間為36 h時，成曲中總黃酮的含量為0.26 mg RE/g，與對照組相比減少了23%。而隨著制曲時間的不斷延長，成曲中總黃酮的含量也呈現先增后減的趨勢。在制曲時間為44 h時成曲中總黃酮的含量達到最大，其總黃酮的含量為0.4 mg RE/g。故選定制曲時間為40,44,48 h進行響應面優化試驗。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果

在單因素試驗的基礎上，選取橘粉添加量、菌種復配比、制曲時間3個因素為自變量，以成曲中總黃酮的含量為響應值，采用Box-Benhnken設計進行響應面試驗，試驗結果見表3。

表3 響應面分析試驗設計方案及結果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

通過 Design Expert 8.0.5b軟件中的Box-Benhnken Design模型對表3中數據進行二次響應面回歸擬合，得到成曲中總黃酮的含量與3個因素之間的回歸方程：Y=0.36+0.014A-3.75×10-3B+7.5×10-3C-0.01AB+7.5×10-3AC+2.5×10-3BC+6×10-3A2+1×10-3B2-1.5×10-3C2，對模型進行方差分析及回歸系數顯著性檢驗，結果見表4。

表4 回歸分析結果Table 4 Results of regression analysis

注：“*”表示差異顯著，P<0.05；“**”表示差異極顯著，P<0.01。

由表4回歸方差分析顯著性檢驗可知，該模型回歸顯著(P<0.05)，失擬項不顯著，說明該模型與實際實驗擬合較好，故響應面方法對柑橘曲料的制備工藝的優化合理可行。

根據表4中：F(A)=26.14，F(B)=1.94，F(C)=7.78可知，各因素條件對成曲品質的影響程度大小順序為：橘粉添加量>制曲時間>菌種復配比。根據顯著性結果可知，回歸方程一次項A極顯著，一次項C和交叉項AB顯著，其他均不顯著。

2.2.2 響應面結果優化與分析

根據Design Expert 8.0.5b軟件，做出各因素對成曲中總黃酮含量的響應面分析圖，考察所擬合的響應面形狀，分析橘粉添加量、菌種復配比、制曲時間對總黃酮含量的影響，其響應面結果見圖4～圖6。

圖4 橘粉添加量和菌種復配比對成曲中總黃酮含量影響的響應面圖

圖5 橘粉添加量和制曲時間對成曲中總黃酮含量影響的響應面圖

圖6 菌種復配比和制曲時間對成曲中總黃酮含量影響的響應面圖

依據Design Expert 8.0.5b軟件對響應面試驗進行優化分析，得到最佳工藝條件：橘粉添加量為9.94%，菌種復配比為3.06∶1，制曲時間為44.6 h，總黃酮含量的理論值為0.402 mg RE/g。考慮實際操作條件，將上述最佳發酵條件修正為：橘粉添加量10%，菌種復配比3∶1，制曲時間44 h。該條件下平行3次測得成曲中總黃酮含量為0.4 mg RE/g，相對誤差為0.5%，說明回歸方程與實際情況擬合較好。

3 結論

在單因素試驗基礎上，利用響應面法，結合Box-Benhnken Design模型的分析，對柑橘黃豆醬制曲工藝進行了優化，進一步得到最優的工藝條件：橘粉添加量為10%，菌種復配比為3∶1，制曲時間為44 h。該條件下測得成曲中總黃酮含量為0.4 mg RE/g，相對誤差為0.5%。利用柑橘皮制備黃豆醬的曲料，該曲料不僅具有顯著的柑橘風味，還可以提高曲料中總黃酮的含量，使該曲料的品質得到提升，同時增加黃豆醬的保健功效和提高柑橘皮的附加值。

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Optimization of Koji-making Process of Citrus Soybean Paste by Response Surface Methodology

PENG Ming-ye1, ZHOU Meng-zhou1, FU Cai-xia2, LI Dong-sheng1, XU Ning1*

(1.Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei Province,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China；2.Hubei Tulaohan Flavouring and Food Co.,Ltd., Yichang 443000, China)

The objectives of this study are to optimize the koji-making process of citrus soybean paste with combination of one-factor-at-a-time method(OFAT) and response surface methodology(RSM)．The influence factors are additive amount of citrus powder, strain multiplexing ratio and koji-making time.The index is the content of total flavonoids in finished koji. The single factor experiment is used to set up the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model about influence factors and index value by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory. The results show that the optimum koji-making conditions are as follows: the additive amount of citrus powder is 10%, the ratio ofAspergillusoryzaeandAspergillusnigeris 3 and the koji-making time is 44 h. Under such conditions，the content of total flavonoids is 0.4 mg RE/g in finished koji, and the relative error with theoretical value is only 0.5%.

citrus powder；Aspergillusoryzae；Aspergillusniger；koji making；total flavonoids

2017-02-10 *通訊作者

湖北省自然基金(2015CFB679)；湖北省科技廳項目(2015BCE028)

彭銘燁(1992-)，男，江西宜春人，碩士，研究方向：食品科學； 徐寧(1979-)，男，陜西渭南人，副教授，博士，研究方向：發酵食品。

TS264.24

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.002

1000-9973(2017)07-0006-05